农杆菌介导反义磷脂酶Dγ基因转化玉米的研究

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本研究利用改良的幼穗注射法将反义PLDγ基因导入玉米自交系郑58、L9801,在卡那霉素筛选的基础上,进行了特异PCR扩增、PCR-Southern杂交检测,结果证明反义PLDγ基因整合到了受体的染色体基因组中;同时对转基因株系后代变异情况、耐盐性、耐旱性及主要农艺性状的差异进行了研究,并利用生物软件对转基因片段进行了分析,主要结果如下:1.首次获得了转反义PLDγ基因的玉米植株。卡那霉素筛选的抗性苗,经特异PCR扩增,11个材料均扩增出大约400bp的目的片段与阳性质粒扩增片段大小相同,PCR-Southern杂交结果与扩增结果一致,说明该基因整合到玉米的基因组中,获得了转反义PLDγ基因的玉米植株。2.T0,T1代中均发现雄性不育单株。在转化的变异系的不同世代中,均发现了许多玉米雄性不育株,该植株相对比较矮小,发育较慢,其雄花絮发育较差,小花分布比较稀疏,后期不能散粉,花药在植株成熟后仍留在颖壳内。雄性不育株与对照在株高、雄花絮长、雄花絮分枝数、结实数等方面均存在显著性差异,株高差异尤为显著,穗位高只是略有变化。3.T1代转基因玉米自然衰老状态下生理指标的测定。结果表明,SOD、POD、可溶性蛋白、CAT在总变化趋势上,转基因植株和对照之间没有显著性的差异,只是起始变化的日期发生了改变,转基因植株衰老日期延缓了约6-10天;丙二醛(MDA)和叶绿素变化则比较明显,MDA是膜脂过氧化的最终产物,它能抑制细胞保护酶的活性和降低抗氧化物的含量,从而加剧膜脂过氧化作用,它反映植物受伤害程度。分析表明转基因植株MDA含量总是低于对照,并且转基因植株叶绿素保持了较高的含量。可见转反义PLDγ基因主要通过抑制膜脂的过氧化作用,从而延缓了植株的衰老。4.转基因玉米株高发生了广泛的变异。夏播T0代株高明显矮于对照,差异达到极显著水平。对温室株高做聚类分析,可以看出T0代郑58株高,发生了不连续的分离,除去几个特殊植株外,如高株177cm、168cm,矮株34cm,在5.60距离处分开,可以将整个群体划分为四个大类群;T0代L9801株高分离的类型较郑58更加丰富,在7.40距离处分开,可以将所得株高划分为6个类群。T1代是T0代温室收获的单穗种成的株行,各株行内个体间基本均匀一致,显著性分析表明,株高和穗位高表现为极显著差异,而同为T1代,株高及其它农艺性状也有差异,分析结果和T0代株高分析相似。T2代株高保持了T1代株高的变异,基本处于稳定。5.转基因株系质膜透性的分析。T0代郑58植株电导率值在1.787-3.611之间呈现不连续的变动。如果从最短距离0.12处分开,可以将数据分为11类,除比较集中的两类外,其它类为单株或少量几株;T0代L9801电导率变动范围在1.143~2.272之间,在最短距离0.09下划分为5类,0.12距离下划分为4类,类和类之间差异显著。对T1代植株取相同部位叶片,用1%NaCL处理2天、4天、6天,然后测电导率,随处理天数的增加,电导率是增加的,但转基因株系均略低于其相应的对照。说明PLDγ反义基因具有提高转化材料的耐盐性或耐旱性的效应。6.转基因株系农艺性状变异广泛。转基因株系在农艺性状上与受体存在显著差异,主要表现为株高、生育期、雄花絮的变异上,Z4.6转基因株系的成熟期明显比受体提早6~10 d,这对改善受体成熟偏晚的缺点极为有利。转基因玉米还存在其它的变异,涉及到植株和籽粒的各种特征,类型相当丰富,包括茎杆颜色、籽粒颜色、籽粒大小和使用除草剂后表现出来的部分耐受性。7.转基因片段的生物软件分析。表明所转反义PLDγ很难在后代中表达成肽段,但是可以从中发现许多的小RNA,该转基因片段的表达可能是因为插入位点处引起DNA的重排或基因沉默,也可能是该片段在核内转录后,被切割成许多的小RNA,而以RNA干涉的形式作用于相关基因,还有可能是转录成RNA后与靶基因的mRNA配对影响翻译。
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