论文部分内容阅读
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,其5年生存率极低。其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌总数的85%。并且大部分NSCLC患者确诊时已出现局部晚期或转移性疾病。因此,其生存便依赖于化疗和靶向治疗的成功,但化疗预后差和靶向治疗耐药性等问题引起我们的关注。所以我们有必要详细研究介导肿瘤发生发展背后的分子机制,从而寻求有效的应对策略。四肽重复域31（TTC31）编码一种含有四肽重复序列的蛋白质。2013年,Franco J等人通过sh RNA array绘制互作通路图,发现和PTEN互作的基因有TTC31,但其功能尚未被鉴定。作者还发现在结肠癌细胞中TTC31敲除后导致在双极纺锤体中出现多个中心体,并显示染色体汇聚缺陷。此外,在TTC31表达缺失的宫颈癌细胞中同样观察到多个中心体表型,表明TTC31对于调节中心体复制和维持染色体稳定上至关重要,并且干扰TTC31促进细胞增殖。因此我们推测TTC31是一种抑癌基因。但TTC31在NSCLC中发挥的功能在很大程度上却是未知的,而且TTC31是否通过PTEN发挥作用也并未探讨。目的:探讨TTC31在NSCLC中的作用,并进一步探讨PTEN表达与否和TTC31发挥功能的具体分子作用机制。研究方法:使用GEPIA数据库,分析TTC31在肺癌及正常肺组织的表达水平;利用Kaplan-Meier数据库分析TTC31表达与总体生存率的关系。通过Western blot检测TTC31在各肺癌细胞系及正常支气管上皮细胞HBE中的表达水平,免疫荧光实验分析TTC31在NSCLC中的定位。利用TCGA数据库判断TTC31表达量高低与临床病理因素的关系。通过在NSCLC中过表达和敲除TTC31,利用集落形成实验和MTS实验检测TTC31对NSCLC增殖的影响,利用流式细胞周期检测和Western blot检测增殖相关蛋白的表达,再利用裸鼠体内成瘤实验,检测体内TTC31表达对NSCLC增殖的影响。通过Bio GRID蛋白互作预测网站寻找PTEN和TTC31之间是否存在相互作用。使用GEPIA数据库分析TTC31和PTEN之间的相关性。使用免疫共沉淀（Co-IP）实验证实TTC31和PTEN之间存在相互作用,再利用免疫荧光实验得出TTC31和PTEN在NSCLC中的共定位。通过在NSCLC中过表达和敲除TTC31,利用Western blot检测PTEN/PI3K/AKT信号通路的变化。最后,给予PTEN抑制剂（HY-128693）后,利用Western blot,集落形成实验和流式细胞周期检测进行该信号通路的回复性验证。结果:1、通过GEPIA数据库发现TTC31在正常肺组织的表达量要高于在肺腺癌和肺鳞癌中的表达,并且在Kaplan-Meier数据库中,TTC31高表达提示肺癌患者预后良好（P＜0.001）。通过Western blot检测TTC31在各肺癌细胞和正常支气管上皮细胞HBE的表达发现,TTC31在正常支气管上皮细胞HBE中表达量最高,在NSCLC细胞H1299中低表达,而在A549细胞中相对高表达。免疫荧光实验发现TTC31在A549和H1299细胞中均定位于细胞核和细胞浆。TCGA数据库显示TTC31在肺腺癌中与T分期和病理分级呈负相关。2、在H1299和A549细胞中分别进行过表达和敲除TTC31,集落形成实验和MTS实验发现过表达TTC31抑制细胞增殖,敲除TTC31促进细胞增殖。经流式细胞周期检测得出TTC31是通过诱导G0/G1期阻滞,抑制S期转化,从而抑制细胞增殖。经Western blot验证,过表达TTC31下调CDK4,CDK6和Cyclin D1表达,而敲除TTC31则上调CDK4,CDK6和Cyclin D1表达。裸鼠体内成瘤实验得出,体内过表达TTC31抑制NSCLC细胞增殖。3、通过Bio GRID蛋白互作预测网站发现PTEN和TTC31之间存在相互作用。通过GEPIA数据库得出TTC31与PTEN存在正相关性。免疫共沉淀（Co-IP）实验证实TTC31与PTEN存在相互作用。免疫荧光实验得出二者共定位于细胞核和细胞浆。Western blot检测得出过表达TTC31上调PTEN表达,同时下调p-AKT和p-m TOR表达,而敲除TTC31则下调PTEN表达,同时上调p-AKT和p-m TOR表达。4、利用PTEN抑制剂（HY-128693）,通过Western blot发现与NC相比过表达TTC31后,p-AKT,CDK4,CDK6和Cyclin D1并未下调。集落形成实验及流式细胞周期检测发现,给予HY-128693后明显逆转了TTC31对细胞增殖的抑制作用,并显著下调了G0/G1期细胞比例,上调了S期细胞比例。结论:1、TTC31在肺正常组织中高表达,并与肺腺癌患者的T分期和病理分级呈负相关。2、TTC31通过和PTEN蛋白互作,增加PTEN蛋白的表达量,进而抑制PI3K/AKT信号通路的激活,从而抑制NSCLC细胞集落形成并诱导细胞周期G0/G1期阻滞。