胸苷是一种嘧啶核苷,作为抗艾滋病药物司他夫定和齐多夫定的前体,随着全球艾滋病患者的不断增加,胸苷的市场需求不断扩大。对菌株进行代谢工程改造并利用微生物发酵法生产胸苷已逐渐取代化学法、酶法成为大规模工业化生产胸苷的理想方法。本文以大肠杆菌MG1655标准株为出发菌株,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对胸苷合成代谢网络进行系统改造,成功构建出一株以葡萄糖为原料,高效稳定生产胸苷的大肠杆菌工程菌THY18。主要研究内容如下:首先,通过引入枯草芽孢杆菌A260的嘧啶核苷操纵子,使菌株能够积累2.11 g/L尿嘧啶。这表明引入pyr操纵子能有效增强UMP合成通量,为进一步提高胸苷产量奠定了基础。随后,敲除了六个与胸苷分解代谢有关的基因deo A,tdk,udp,rih A/B/C。摇瓶结果显示,菌株THY7胸苷积累量达0.18 g/L,且副产物尿嘧啶消失,另一副产物尿苷积累量达到5.56 g/L。接着,为了增强胸苷下游合成途径,过表达了大肠杆菌的尿苷酸激酶突变基因pyr HD93A。摇瓶结果显示,胸苷产量为0.31 g/L,与对照相比增加了70.5%,副产物尿苷产量与对照相比减少了90.6%,说明代谢流从尿苷合成途径引入下游胸苷合成途径。随后,又整合了来自T4噬菌体的td基因和大肠杆菌自身的nrd A/B/C操纵子,得到的菌株THY9和THY10-2,胸苷产量分别为0.33 g/L和1.01 g/L。其中菌株THY10-2较菌株THY9胸苷产量提升了204.2%,证实了核糖核苷二磷酸还原酶在胸苷合成过程中的关键作用。随后分别探究了ndk,dcd,dut,pyr G*cgl基因对胸苷合成的影响,并将ndk,dcd,dut基因进行组合表达,胸苷产量增加至1.33 g/L。最后比较了来自大肠杆菌内源和噬菌体PBS1来源的5’-核苷酸酶,分别得到菌株THY17和THY18,摇瓶结果显示,THY17和THY18的胸苷产量分别为1.34 g/L和1.81 g/L。表明噬菌体PBS1来源的5’-核苷酸酶在水解胸苷酸合成胸苷能力上明显强于大肠杆菌中的5’-核苷酸酶。最后,在2 L发酵罐分批补料发酵条件下,菌株THY18培养36 h胸苷产量可达7.83 g/L,生产强度为0.22 g/L/h,转化率为2.7%,为后续的工程菌改进和工业化应用奠定了基础。