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研究背景：前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)是花生四烯酸环氧合酶代谢产物,为二十碳不饱和脂肪酸,PGE2主要通过细胞膜上的四种G蛋白偶联受体(GProtein-Coupled Receptors, GPCRs),即EP1、EP2、EP3、EP4发挥跨膜信号转导作用。多项研究证实,PGE2能够显著促进多种肿瘤的增殖、侵袭和转移,本实验室前期研究结果也表明PGE2能够显著增加肝细胞癌和胆管细胞癌的增殖侵袭能力。有报导,肿瘤的侵袭转移与Snail蛋白水平的增高密切相关,但PGE2通过调控Snail蛋白水平促肝癌侵袭的具体机制尚不清楚。本课题在实验室前期已有工作基础上,进一步探讨PGE2调控Snail促进肝癌侵袭转移的分子机制。研究目的：阐明PGE2通过EP4受体激活AKT/NF-κB信号转导通路上调Snail,从而促进肝癌侵袭转移的机制。研究内容：1. Snail蛋白与人肝癌侵袭关系的研究2.PGE2通过激活EP4受体对Snail的调控研究3.EP4受体激动上调肝癌细胞Snail表达的信号转导通路和分子机制研究方法：1.免疫组织化学实验检测临床肝癌标本中Snail蛋白及信号通路中相关靶点蛋白的表达情况。2.常规方法培养肝细胞癌Huh7细胞。3.WST实验检测PGE2和EP4受体激动剂处理对肝细胞癌细胞生长的影响。4. Transwell实验检测PGE2和EP4受体激动剂处理对肝细胞癌细胞侵袭能力的影响。5. Real-Time PCR实验检测肝细胞癌细胞中PGE2和EP4受体激动剂处理对Snail mRNA水平的影响。6.RNA干扰处理,抑制肝细胞癌细胞EP4受体的表达后,检钡Snail蛋白及信号通路中信号靶点的改变。7. Western blot实验检测PGE2经EP4受体上调Snail蛋白表达的信号转导通路中相关靶点的蛋白表达改变。8.荧光素酶报告基因实验检测NF-κB-P65蛋白是否结合在Snail蛋白的起始部位,并促进了Snail蛋白的转录。9.激光共聚焦显微实验检测EP4受体激动剂处理对肝癌细胞中NF-κB-P65亚基入核的影响。10. Western blot实验检测EP4受体激动剂引起GSK-3β的活化后,在泛素化水平对Snail蛋白表达的影响。研究结果：1.免疫组织化学EliVisionTM super二步法实验结果表明,与癌旁正常肝组织相比,肝癌组织中Snail蛋白表达显著上调。低分化组与对照组相比,Snail蛋白表达上调了1.64倍,高分化组与对照组相比,Snail蛋白表达上调了0.47倍。Transwell实验结果表明当Huh7细胞转染了Snail蛋白的干扰质粒P-Super-Snail shRNA之后,PGE2和EP4受体激动剂处理促肝癌细胞侵袭能力较空载对照组明显下降。2.在肝癌细胞Huh7细胞系中,外源性PGE2处理肝癌细胞Huh7细胞24h,细胞内Snail蛋白的表达水平显著上升,E-cadherin表达明显下降,其中10MPGE2处理细胞导致Snail蛋白上升及E-cadherin下降作用最显著,与对照组相比,Snail上调了1.78倍,E-cadherine下降了2.5倍；EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal处理Huh7细胞可以显著上调细胞内Snail的蛋白表达,其中10μM时上调作用最显著,达到对照组的3.67倍(图4A和B),同时E-cadherin下调作用显著(图4C和D),达到对照组的4.08倍。3.在Huh7细胞中,通过Transwell实验观察,当EP4受体被干扰之后,PGE2诱导细胞内Snail蛋白水平较单纯PGE2刺激组相比下降了2.01倍。4.EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal10μM处理Huh7细胞后,Realtime PCR实验结果显示细胞内Snail mRNA水平发生显著变化,24小时时mRNA水平较对照组0小时增加了2.02倍。EP4受体激动剂处理引起CREB的磷酸化水平上升,30分钟时作用最明显,为对照组的4.01倍。将抑制性DN-CREB质粒转染进Huh7细胞,以空载pRc/CMV质粒作为对照,再用EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal处理细胞,结果显示与对照比较,CREB功能被抑制后,并未阻断EP4受体激动剂对Snail蛋白表达的上调作用。5.EP4受体激动剂Prostaglanding El Alchoal处理Huh7细胞45分钟时,EGFR磷酸化水平明显上调,为对照组的2.5倍,0-60分钟时间段内均可见AKT Thr308的磷酸化水平增高,以30分钟时作用最明显,较对照组上调3.33倍。给予肝癌细胞EP4受体激动剂和EGFR抑制剂AG1478后,AKT的磷酸化水平明显下降,较单一受体激动剂处理组下调了1.69倍。6.10μM EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal处理Huh7细胞后,IκB磷酸化水平明显增高,以60分钟时磷酸化水平上调最为显著。上述处理细胞在0-3小时内未观察到NF-κB-P65蛋白的磷酸化水平明显增高,而在4小时时的时间点观察到NF-κB-P65的磷酸化水平明显增高。用PI3K特异性抑制剂LY294002预处理Huh7细胞1小时后,用EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal作用Huh7细胞4小时,结果显示EP4受体激动诱导的NF-κB-P65磷酸化水平上调作用明显被PI3K抑制剂阻断。7.10μM EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal处理Huh7细胞25分钟后胞核中NF-κB-P65染色水平明显增高(粉色显色,根据三原色原理,粉色为红色和蓝色融合后的颜色)。证明NF-κB-P65磷酸化后入核现象明显,且4小时时入核作用最明显。8.免疫组织化学EliVisionTM super实验结果显示,与正常对照组织相比,NF-κB在肝癌组织中表达明显增加,呈强阳性并且阳性表达定位于细胞核,正常肝细胞中胞膜、胞浆及胞核未见棕黄色颗粒沉着。免疫组织化学双抗体标记(Dou SPTM法)实验显示,NF-κB与Snail共同表达于肝癌中,NF-κB呈红色,Snail呈棕黄色。二者同时显色的细胞即为NF-κB/Snail阳性细胞(棕黑色)。9.双荧光素酶报告基因实验显示,用pRL-SV40为载体的NF-κB-P65过表达质粒和Snail的启动子质粒共转染Huh-7细胞,以pGL3-Control作为阴性对照,共孵育72小时,通过荧光强度的绝对值分析,结果显示NF-κB-P65对Snail发挥了正向转录调节作用,72小时时的转录水平达到峰值。10.10μM EP4受体激动剂Prostaglanding E1Alchoal处理Huh7细胞后,GSK-3β磷酸化水平明显增高,以30分钟时磷酸化水平上调最为显著,为对照组的1.67倍。结论：PGE2经EP4受体以非G蛋白偶联的方式,即EGFR反式活化后激活PI3K/AKT信号,活化转录因子NF-κB,上调了Snail在肝癌中的转录活性；此外,EP4受体激活后使GSK-3β磷酸化失活,降低了对Snail的泛素化降解作用,使Snail稳定性增加；这两方面的协同作用共同上调了Snail在肝癌中的表达。