造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)是一种能够自我更新和分化为所有血系细胞的成体干细胞,虽然在体内数目稀少,但在造血发生和免疫系统中有着重要的作用。目前,造血干细胞移植是治疗和治愈恶性血液病、重型再生障碍性贫血、一些实体瘤等疾病最有效的方法。然而,造血干细胞来源有限、数量不足和扩增困难等缺陷,是造血干细胞移植治疗血液疾病的难关。近年来,通过大量基因敲除小鼠模型和白血病人的血液分析鉴定出许多与造血系统密切相关的转录因子,这些转录因子在造血干细胞自我更新和成熟分化中发挥重要作用。人们思考能否通过这些转录因子将病人的其它细胞转分化为造血干细胞。已有文章表明转录因子可以将小鼠的内皮细胞转分化为造血干细胞。也有文章报道可以把人的诱导多潜能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)分化为生血内皮,再通过转录因子诱导分化为造血干细胞。对人而言,内皮细胞是一种难以获得的细胞,而iPSCs的安全性无法保证,所以我们希望采用易获取、损伤小的成纤维细胞转分化为造血干细胞。因此,本文以小鼠为模型,试图将小鼠的成纤维细胞转分化为造血干细胞,然后再将这套转分化系统利用到人的造血干细胞转分化实验中。目前,有两篇文章尝试用转录因子转分化小鼠成纤维细胞为造血干细胞,但最终只得到了造血祖细胞,原因很可能是没有找到在造血干细胞生成和调控中真正关键的转录因子。根据刘兵课题组利用单细胞测序追踪小鼠造血干细胞的数据,我们将T1 pre-HSC signature genes、T2 pre-HSC signature genes和BM HSC signature genes做交集,得到34个共同高表达的基因,对这34个共同高表达的基因进行分析,发现其中含有13个转录因子(Gfi1、Hif3a、HIf、Irf2、Meis1、Mllt3、Mpl、Mycn、Nfix、Nkx2-3、Scl、Stat4、Vdr)和1个表观遗传调控因子(Dnmt3b)。查阅相关文献,得知这14个调控因子中很多在HSC的生成和自我更新上有重要的作用,所以本课题构建了这14个调控因子的过表达质粒载体,试图转分化小鼠成纤维细胞为造血干/祖细胞。同时,将已有关于小鼠成纤维细胞转分化为造血祖细胞文章中使用的转录因子Erg、Gata2、Lmo2、Runx1和Bmi1也进行了质粒载体构建,希望找到最佳的调控因子组合。首先,通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)获得这19个调控因子的CDS序列,将CDS序列连接到Blunt载体上,酶切并测序验证。然后,用含有同源臂的引物进行PCR获得同源序列,通过同源重组将序列连入pMXs表达载体上。最后,利用特异PCR鉴定了pMXs载体上的基因能在MEFs中正常表达。本课题从小鼠13.5天胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs),作为转分化的起始细胞。对OP9细胞的辐照强度和接种密度进行了探索,得到了最佳的辐照强度和接种密度。同时,构建了状态良好的OP9-DL1细胞作为支持细胞。为了提高病毒的质量,本实验对磷酸钙转染的方法进行了优化,找出了钙转较好的质粒用量、2*HBS的PH值、方法、和时间点。经过对感染效率的优化,得知将浓缩50倍的12种病毒各14ul来感染MEFs,可以达到50%以上的感染效率,说明采用探索出的钙转和感染方法能进行小鼠成纤维细胞转分化为造血干/祖细胞的研究。所以本论文研究为成纤维细胞向造血干细胞转分化建立了前期平台,为体外高效获取造血干细胞带来了希望。