磁性微粒-化学发光免疫法对二甲氧基类有机磷农药多残留检测研究

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有机磷农药是世界上使用最广泛的杀虫剂,相应的,其产生的污染也最普遍、最严重。有机磷农药因结构不同可分为二甲氧基类和二乙氧基类,对武汉市近20家农药店进行市场调查发现,目前正在使用的二甲氧基类有机磷农药主要有敌百虫、敌敌畏、杀扑磷、马拉硫磷、稻丰散、杀螟硫磷、倍硫磷、乐果、氧乐果和甲基毒死蜱等。现在人们越来越关注环境和食品中农药污染,这要求我们对农药实行更广泛更严格的监测,传统的检测方法不能满足现场快速检测的需要,有必要寻找快速、易操作、稳定、灵敏和低成本的速测法实现对现场大量样品的初筛,本课题初步建立的检测农产品中二甲氧基类有机磷农药多残留的磁免疫化学发光分析方法,使其成为可能。(1)选择S-羧乙基-O,O-二甲基硫代磷酸酯作为二甲氧基类有机磷农药通用半抗原进行合成。半抗原的制备分两步,经柱层析纯化,洗脱液为甲醇:三氯甲烷=1:8,产物得率:11.5%。红外鉴定结果初步判断,该产物具有二甲氧基和羧基结构,与半抗原结构相符,质谱鉴定ESI-MS(m/z)213.2[M-H]-与半抗原分子量一致,即半抗原制备成功。(2)采用半抗原结构类似物O,O-二甲基硫代磷酰氯与鲁米诺反应制备O,O-二甲基硫代磷酰氯化学发光标记物,此标记物既含有二甲氧基有机磷农药的共性结构,又含有鲁米诺的发光基团,产物经柱层析纯化,洗脱液配比为乙酸乙酯:石油醚=1:6,产物得率:20.1%。产物紫外鉴定表明产物与鲁米诺均有三个特征吸收峰,且产物因含有-(OCH3)2吸收峰向长波方向移动,红外鉴定表明产物具有二甲氧基和鲁米诺的特征基团结构,质谱鉴定ESI-MS(m/z)300.3[M-H]-与O,O-二甲基硫代磷酰氯化学发光标记物的分子量一致即O,O-二甲基硫代磷酰氯化学发光标记物制备成功,进行后续实验。(3)O,O-二甲基硫代磷酰氯化学发光标记物在碱性条件下产生化学发光,表现出良好的发光动力学,且体系碱性越强和过氧化氢浓度越高,其发光强度越大。在10-160 mg/L范围内发光线性良好,标准曲线为y=252.755x+5729.167,相关系数R=0.9984。标记物以固体形式在4℃冰箱中储存。(4)抗二甲氧基有机磷农药多克隆抗体分别与四种磁性微粒偶联,四种免疫磁珠偶联率由大到小依次为:金磁微粒、异硫氰酸根、氨基末端和羧基末端磁粒,金磁微粒与抗体的偶联率最高,达到80%以上。在4℃下,金磁微粒免疫磁珠的稳定性最好,分解率低。采用金磁微粒作为抗体的载体进行后续实验。(5)建立了农产品中有机磷农药多残留检测的磁免疫化学发光分析方法,采用单因素对该方法进行条件优化。结果表明:金磁微粒-免疫磁珠和O,O-二甲基硫代磷酰氯化学发光标记物的最适工作浓度分别为175μg/L和40μg/L,反应体系最适p H为9,过氧化氢浓度为0.4 mmol/L,反应时间为50 min。在最佳反应条件下,对该农药检测方法进行性能评估,包括线性、最低检测限、精密度、特异性、基质影响和准确度。结果显示:敌敌畏、甲基毒死蜱和杀螟硫磷的线性关系良好,R大于0.99,乐果的线性较差,四种农药的线性范围为10-250μg/L,检测限分别为8.98μg/L、7.74μg/L、10.04μg/L和6.17μg/L;批内精密度范围为3.4%-6.7%,批间精密度范围6.5%-8.5%,精密度良好;在交叉反应中,敌百虫和马拉硫磷具有二甲氧基结构,交叉反应率超过95%,三唑磷和毒死蜱应具有二乙氧基结构,交叉反应率小于10%,百菌清结构差异大,基本上不存在交叉反应,该方法对二甲氧基有机磷农药具有良好的特异性识别。为降低实际检测中样品基质对检测结果的影响,对样品进行两倍稀释,在样品加标回收率试验中,样品回收率在87.7%-110.7%之间,相对标准偏差在4.9%-15.7%之间,准确度良好,能够用于果蔬等农产品的检测。
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