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第一部分:丝素纤维/壳聚糖三维支架的仿生矿化及筛选目的:探讨丝素纤维/壳聚糖复合支架作为矿化模板的可行性,并研究不同矿化时间对支架形貌、成分、理化性质及其对MC3T3-E1细胞行为的影响。方法:采用物理、化学结合的方法制备柞蚕丝素纤维（AF）,将其与与壳聚糖（CS）按照3:4（w/w）的比例混匀,经冷冻干燥制备柞蚕丝素纤维/壳聚糖（AF/CS）三维支架。将支架浸泡入Na OH水溶液中进行不溶处理后,将其以1:1000的浴比浸泡于5×模拟体液（SBF）中进行仿生矿化。通过扫描显微镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FTIR）、X射线衍射分析（XRD）,力学研究及溶血实验方法对不同时间点（0、12h、24h、48h）的矿化丝素纤维/壳聚糖支架（m AF/CS）进行结构、形貌和成分的观察和毒性实验分析。然后将成骨细胞MC3T3-E1接种于AF/CS及m AF/CS支架表面,通过CCK-8实验、死活细胞染色、黏附实验、碱性磷酸酶（ALP）染色及活性测试和Real-Time PCR（RT-PCR）检测黏附基因,最终确定最佳矿化时间,并确认矿化的AF/CS支架是否提供了促进增殖、黏附和分化的仿生微环境。结果:AF/CS支架具有良好的孔隙结构,随着矿化时间的延长,可见支架表面逐渐形成了较为完整且致密的矿化层。但当矿化达48h时,羟基磷灰石大量堆积导致支架的孔隙变小甚至封闭。XRD和FTIR的结果表明,经历不同矿化时间后的AF/CS模板沉积在表面的羟基磷灰石晶型几乎一致。力学测试表明,随着矿化时间的延长,相应支架的力学性能显著增加。溶血实验观察结果表明,矿化前后支架均具有良好的血液相容性。此外,细胞毒性实验（CCK-8）和Calcein-AM/PI活死细胞染色表明,矿化后支架均具有良好的细胞相容性和促增殖作用,但矿化48h后的支架上出现较多的死细胞;细胞形态学结果表明支架的仿生矿化促进了细胞在材料表面的黏附和生长。此外,m AF/CS组的黏附相关基因表达水平明显高于AF/CS组。相较于未矿化支架,矿化处理后的支架的碱性磷酸酶活力检测活性也明显增高,特别是矿化24h后的支架。结论:综上,AF/CS支架具有良好的仿生矿化功能,且矿化修饰的AF/CS复合支架为细胞的增殖、黏附和分化提供了良好的生物物理线索。其中,矿化24h的支架不仅保留良好的孔隙结构,且生物学评价效果最好,适于作为骨修复支架。第二部分:负载丹酚酸B和活性锶的仿生矿化丝素纤维/壳聚糖三维支架的体外研究目的:通过仿生矿化的自组装作用,制备负载丹酚酸B（Salvianolic Acid B,Sb）和活性锶（Sr2+）的功能化仿生矿化丝素纤维/壳聚糖三维支架（m AF/CS-Sb@Sr）,并研究其在体外对成骨/成血管的作用。方法:将Sr Cl2（按照Sr Cl2/Ca Cl2摩尔比为1:9）及其浓度为160mg/L的Sb分别/同时溶解在5×SBF中,制备孵育支架孵育液体体系后,将AF/CS支架置于其中进行孵育,孵育24h后通过冷冻干燥技术制备负载Sb的矿化支架（m AF/CS-Sb）,负载Sr2+的矿化支架（m AF/CS-Sr）以及负载Sr+Sb的矿化支架（m AF/CS-Sr@Sb）。随后采用SEM、FTIR研究对材料进行表征,同时测定Sr2+和Sb的体外释放曲线。在评估成骨分化方面,构建上述各组矿化支架与人骨髓间充质干细胞（h MSCs）细胞的共培养体系,采用CCK-8法和CalceinAM/PI活死细胞染色检测支架与细胞的相容性;通过Transwell试验及碱性磷酸酶（ALP）/茜素红（ARS）染色分析支架对h MSCs细胞的成骨分化效应;采用RT-PCR和Western blot检测相关成骨基因ColⅠ、ALP、OCN、Runx2在m RNA及蛋白层面的表达水平。在评估体外成血管能力方面,建立各组支架与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的共培养体系后,通过细胞增殖检测、成管实验及RT-PCR检测支架对细胞血管新生以及成血管分化相关基因VEGF和HIF-1ɑ表达的影响。结果:m AF/CS,m AF/CS-Sb,m AF/CS-Sr和m AF/CS-Sb@Sr四组支架均具有良好互通性的孔隙结构,且Sr2+和Sb成功引入支架。与Sb相比,Sr2+具有更持久的释放特征。h MSCs细胞在各组支架上均有较高的活力,相较于Sr2+/Sb单独引入支架的组而言,m AF/CS-Sb@Sr组的h MSCs细胞迁移能力明显增强。m AF/CS-Sb@Sr组复合支架组的h MSCs细胞的成骨能力最强。而且,Sr2+和Sb共同引入矿化支架显著上调了成骨相关基因ALP、RUNX 2、OCN和Col1的表达。在体外成血管能力评价方面,相较于m AF/CS组和m AF/CS-Sr组,m AF/CS-Sb和m AF/CS-Sb@Sr组的细胞增殖率较高,其中m AF/CS-Sb组促增殖作用最高,m AF/CS-Sb@Sr组次之。m AF/CS-Sb@Sr组的促成管能力最为显著。此外,RT-PCR分析结果显示,m AF/CS-Sb@Sr组的成血管相关因子VEGF、HIF-1ɑ的表达水平明显高于其他三组。结论:负载Sb和Sr2+的功能化仿生矿化丝素纤维/壳聚糖三维支架（m AF/CS-Sb@Sr）不仅保留了良好互通的孔隙结构和微/纳米形貌,并可持续释放Sb及Sr2+,为骨的修复提供了良好的条件。m AF/CS-Sb@Sr支架具有良好的细胞相容性,通过释放Sb和Sr2+,在促进血管生成、诱导成骨分化方面具有协同作用。第三部分:负载丹酚酸B和活性锶的仿生矿化丝素纤维/壳聚糖三维支架的体内研究目的:评价负载Sb和Sr2+的功能化仿生矿化支架（m AF/CS-Sb@Sr）修复大鼠颅骨临界性骨缺损的能力。方法:根据处理颅骨缺损方法的不同,将50只体重在220-260克的雄性SD大鼠随机分为五组:丝素纤维/壳聚糖支架组（AF/CS组）,矿化丝素纤维/壳聚糖支架组（m AF/CS组）,负载Sb的矿化丝素纤维/壳聚糖支架组（m AF/CS-Sb组）,负载Sr2+的矿化丝素纤维/壳聚糖支架组（m AF/CS-Sr组）,负载Sb+Sr2+的矿化丝素纤维/壳聚糖支架组（m AF/CS-Sb@Sr）。各组支架经灭菌后分别置入SD大鼠颅骨缺损处。术后4周和8周每组随机处死5只大鼠,通过micro CT三维重建技术比对各组骨缺损修复情况,通过HE染色,Masson染色,免疫组织化学Col I染色分析评估新骨形成的情况,同时CD31染色分析评估新生血管情况。结果:术后4周,对照组缺损部位几乎未见新骨形成,新的骨组织仅在有限体积的缺损边缘发芽。对比发现,在m AF/CS组,m AF/CS-Sb组,m AF/CS-Sr组和m AF/CS-Sb@Sr组中,均有不同程度的新形成的骨从缺损边缘向支架间隙穿透生长。其中m AF/CS-Sb@Sr组的新骨生长最显著。m AF/CS-Sb和m AF/CSSr两组组间的BV/TV和BMD无明显差异。植入颅骨缺损8周时,各组新生骨生长较4周时明显增加,m AF/CS-Sb@Sr组中颅骨缺损部位几乎完全被修复。m AF/CS-Sb@Sr支架组的BV/TV和BMD均高于其他四种支架。HE染色及免疫组织化学染色分析同样显示术后4周,对照组的缺损区主要以大量纤维结缔组织为主,未见明显的新生骨形成;各支架组缺损区均有新生骨的形成。术后8周,各支架组组缺损区的新生骨较4周时均显著增多。CD31染色染色显示术后4,8周,m AF/CS-Sb组,m AFCS-Sr组和m AF/CS-Sb@Sr三组的新生血管密度显著增高,其中m AF/CS-Sb@Sr组的新血管密度生长最显著。结论:m AF/CS-Sb@Sr复合支架不仅通过矿化模拟了天然骨ECM,为成骨提供理想的微环境,且持续释放的Sr2+/Sb在协同促进血管新生和成骨上具有协同作用,具有较强的促骨再生的能力,是一种较为理想的骨组织工程修复材料。