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颗粒蛋白前体(Progranulin,PGRN)是近年发现的一种重要生长因子,既可以调控细胞生长繁殖与伤口愈合,同时也可以调节炎症和神经的退化,其单体颗粒蛋白(Granulin,GRN)则扮演着与其相反的功能。在本实验室基因数据库中找到一条PGRN类似的序列,使用3′Race及5′Race技术扩增得到该序列全长,经过分析后将其命名为L-GRN(Lampreygranulin,L-GRN)。本文根据L-GRN氨基酸序列进行生物信息学分析得到了有关L-GRN蛋白质结构、功能、理化性质等重要数据,同时还构建了GRN的进化树及同线性来分析GRN的进化过程。
本文将L-grn在HEK293T细胞中过表达,进行了转录组测序并对转录组数据结果分析,通过GO分类,COG分类、KEGG分类与KEGG通路富集等分析,对L-GRN潜在的功能进行了分子水平上的预测,预测结果发现L-GRN可能参与细胞的生长与免疫。
此外,本文对L-grn全长构建了pColdⅠ-L-grn原核质粒并表达纯化出包涵体rL-GRN(recombinant L-GRN,rL-GRN)蛋白质,但是为进一步研究L-GRN蛋白的功能则需要纯化可溶性且具有活性的蛋白质,因此对L-GRN的高度保守的GRN结构域构建了pET-32a(+)-L-grn质粒,并且表达纯化出了可溶性的分段rL-GRN蛋白。然后使用全长rL-GRN蛋白制备多克隆抗体,并检测其效价及特异性。通过免疫印迹、免疫组化、免疫荧光及流式分析等手段对L-GRN在七鳃鳗组织与细胞中进行了定位研究,结果发现L-GRN蛋白主要分布于七鳃鳗神经轴体、心、肝和鳃等组织中,并且在神经轴体组织中表达量最高,细胞水平上则发现L-GRN主要定位于神经轴体、肝及白细胞的细胞质中。
最后,通过CCK-8试剂盒检测得出分段可溶性rL-GRN蛋白可以促进HEK293T细胞和HUVEC细胞增殖,同时通过划痕及Transwell实验则证明分段rL-GRN可以促进HUVEC细胞迁移;而在七鳃鳗中,通过Transwell实验发现rL-GRN可以趋化神经轴体细胞迁移并吞噬poly I:C-FITC,经过qPCR、免疫印迹及流式细胞术分析后得出L-GRN可能是通过调节趋化因子LECT2的表达来行使这些功能的;此外,研究发现七鳃鳗受到外界不同抗原刺激时,L-grn的相对表达量上调,证明L-GRN参与七鳃鳗的免疫反应;表面等离子共振技术结果表明rL-GRN与rL-TNFR有相互作用,说明L-GRN可能在七鳃鳗炎症中起到关键作用。因此,本研究证实L-GRN作为一种七鳃鳗趋化因子与免疫调节分子参与趋化神经轴体细胞的迁移和免疫反应。
本文将L-grn在HEK293T细胞中过表达,进行了转录组测序并对转录组数据结果分析,通过GO分类,COG分类、KEGG分类与KEGG通路富集等分析,对L-GRN潜在的功能进行了分子水平上的预测,预测结果发现L-GRN可能参与细胞的生长与免疫。
此外,本文对L-grn全长构建了pColdⅠ-L-grn原核质粒并表达纯化出包涵体rL-GRN(recombinant L-GRN,rL-GRN)蛋白质,但是为进一步研究L-GRN蛋白的功能则需要纯化可溶性且具有活性的蛋白质,因此对L-GRN的高度保守的GRN结构域构建了pET-32a(+)-L-grn质粒,并且表达纯化出了可溶性的分段rL-GRN蛋白。然后使用全长rL-GRN蛋白制备多克隆抗体,并检测其效价及特异性。通过免疫印迹、免疫组化、免疫荧光及流式分析等手段对L-GRN在七鳃鳗组织与细胞中进行了定位研究,结果发现L-GRN蛋白主要分布于七鳃鳗神经轴体、心、肝和鳃等组织中,并且在神经轴体组织中表达量最高,细胞水平上则发现L-GRN主要定位于神经轴体、肝及白细胞的细胞质中。
最后,通过CCK-8试剂盒检测得出分段可溶性rL-GRN蛋白可以促进HEK293T细胞和HUVEC细胞增殖,同时通过划痕及Transwell实验则证明分段rL-GRN可以促进HUVEC细胞迁移;而在七鳃鳗中,通过Transwell实验发现rL-GRN可以趋化神经轴体细胞迁移并吞噬poly I:C-FITC,经过qPCR、免疫印迹及流式细胞术分析后得出L-GRN可能是通过调节趋化因子LECT2的表达来行使这些功能的;此外,研究发现七鳃鳗受到外界不同抗原刺激时,L-grn的相对表达量上调,证明L-GRN参与七鳃鳗的免疫反应;表面等离子共振技术结果表明rL-GRN与rL-TNFR有相互作用,说明L-GRN可能在七鳃鳗炎症中起到关键作用。因此,本研究证实L-GRN作为一种七鳃鳗趋化因子与免疫调节分子参与趋化神经轴体细胞的迁移和免疫反应。