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第一部分 活性维生素D通过改善氧化应激状态延缓NAFLD的发生发展目的:探究活性维生素D对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠氧化应激和肝脏脂质沉积的影响。方法:基因敲除小鼠1α-羟化酶[1α(OH)ase]构建活性维生素D缺乏的模式动物(以下称KO小鼠),通过高脂饮食10周构建NAFLD小鼠模型;实验分为8组:常规饮食(RD)的WT+RD组和KO+RD组、高脂饮食(HFD)诱导NAFLD模型的WT+HFD组和KO+HFD组、抗氧化NAC饮水处理的WT+HFD+NAC组和KO+HFD+NAC组、活性维生素D补充的WT+HFD+VD组和KO+HFD+VD组。通过生化分析仪检测小鼠血清中CHO、TG、AST;ELISA方法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平;qRT-PCR 检测乙酰辅酶 A 羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)、ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)mRNA表达;HE染色、油红“O”染色、FAS免疫组化检测小鼠肝脏组织学变化;TBA 比色法检测氧化代谢产物丙二醛(malondialodehyde,MDA)含量、流式细胞术检测肝脏匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,qRT-PCR 检测肝脏匀浆双氧化酶-1/2(dual oxidase,DUOX-1/2)的 mRNA 表达,Western blot检测肝脏匀浆中超氧化物歧化酶-1/2(superoxide dismutase,SOD-1/2)和过氧化物酶 1(peroxiredoxin 1,PRDX 1)的表达水平。结果:1、在RD饮食的小鼠中,活性维生素D缺乏的KO小鼠除了体重轻于WT小鼠外(KO+RD vsWT+RD,P<0.05),肝湿重与肝脏指数并无明显差异。2、HFD饮食诱导小鼠NAFLD,KO+HFD组的疾病指标均显著高于WT+HFD组,表现为:(1)临床指标CHO、TG、ALT、TNF-α和IL-6含量均显著增加(P<0.05);(2)肝脏中脂质合成相关蛋白酶ACC、ACL和FAS的mRNA表达量,以及FAS免疫组化染色阳性率均显著增加(P<0.05);(3)肝脏油红“O”染色可见更多脂滴沉积;(4)肝脏组织学变化中,肝湿重、肝脏指数均显著增加;(5)HE染色表现为肝细胞气球样变和点灶状坏死。表明活性维生素D缺乏可加重小鼠NAFLD的进展。3、HFD饮食诱导NAFLD小鼠的氧化应激均显著增加,其中活性维生素D缺乏的KO+HFD组的氧化应激指标均显著异常于WT+HFD组,表现为:(1)肝脏过氧化产物MDA、促氧化指标Duox1 mRNA和Duox2 mRNA水平均显著增加(P<0.05);(2)抗氧化指标GSH-Px、SOD1、SOD2、PRDX1的表达均显著降低(P<0.05);表明活性维生素D缺乏可进一步促进NAFLD小鼠的氧化应激反应。4、对NAFLD小鼠分别给予抗氧化NAC饮水或活性维生素D补充,结果显示:WT+HFD+NAC组和KO+HFD+VD组小鼠的过氧化产物MDA、促氧化指标Duox1 mRNA和Duox2 mRNA水平均显著下降,抗氧化指标GSH-Px、SOD1、SOD2、PRDX1的表达均显著增加(P<0.05);而且肝脏中脂滴沉积、肝细胞气球样变和点灶状坏死均显著减少。结论:活性维生素D补充可通过改善氧化应激水平,减轻小鼠肝脏脂肪变性,从而缓解NAFLD的病程。第二部分 活性维生素D通过抑制p53-p21信号通路改善NAFLD的发生发展目的:探究活性维生素D如何通过抗氧化应激改善小鼠NAFLD进展的效用机制。方法:实验分为8组:常规饮食(RD)的WT+RD组和KO+RD组、高脂饮食(HFD)诱导NAFLD模型的WT+HFD组和KO+HFD组、抗氧化NAC饮水处理的WT+HFD+NAC组和KO+HFD+NAC组、活性维生素D补充的WT+HFD+VD组和KO+HFD+VD组。TUNEL法检测小鼠肝脏细胞凋亡情况,SA-β-Gal染色检测肝脏细胞衰老情况,Western blot检测参与脂质合成的ACC、固醇调节元件结合转录因子1(sterol regulatory element binding transcription factor SREBP1-C)和参与脂质转运的微粒体甘油三酸酯转移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTTP),检测 p53、p21、p16等信号通路分子的表达,油红“O”染色和FAS免疫组化检测小鼠肝脏脂肪变性情况。结果:1、与RD饮食的WT小鼠比较,活性维生素D缺乏小鼠肝脏细胞中衰老相关指标:细胞凋亡率,SA-β-Gal染色阳性率,脂质代谢蛋白ACC、SREBP1、MTTP的表达,以及p53、p21和p16信号通路分子的表达均无明显差异(P>0.05)。2、在HFD饮食诱导NAFLD小鼠中,肝脏细胞衰老相关的指标均显著增加,其中活性维生素D缺乏的KO+HFD组显著异常于WT+HFD组,表现为:(1)肝细胞凋亡率、SA-β-Gal染色阳性率、脂质合成蛋白(ACC、SREBP1)的表达均进一步增高(P<0.05);(2)脂质转运蛋白MTTP表达进一步减少(P<0.05);表明活性维生素D缺乏能进一步促进NAFLD小鼠肝脏细胞衰老及脂质沉积的发生。3、抗氧化NAC饮水或活性维生素D补充能显著降低NAFLD小鼠的肝细胞凋亡率,SA-β-Gal染色阳性率,减少脂质合成蛋白(ACC、SREBP1)和增加MTTP蛋白表达。4、与RD饮食的同型小鼠相比较,HFD饮食诱导NAFLD小鼠中,WT+HFD组和KO+HFD组小鼠的肝匀浆中p53、p21和p16表达均显著增加(P<0.05),其中KO+HFD组p53、p21蛋白表达均显著高于WT+HFD组(P<0.05)。5、抗氧化NAC饮水或活性维生素D补充能显著降低p53、p21和p16表达,减少脂质合成蛋白(ACC、SREBP1)和增加MTTP蛋白表达。6、沉默小鼠肝脏p53基因后饮食诱导NAFLD,与sh-NC组相比,sh-p53组小鼠肝脏p53、p21蛋白的表达显著降低(P<0.05),油红“O”染色显示脂肪变性显著降低(P<0.01),FAS组化染色阳性率及SA-β-Gal阳性率同样显著减少(P<0.05)。结论:活动维生素D可通过抗氧化应激调控p53-p21信号通路,抑制小鼠肝细胞衰老及凋亡,减少肝脏脂肪变性,从而发挥缓解NAFLD的效用。第三部分 骨化三醇对非酒精性脂肪性肝病患者氧化应激及胰岛素抵抗的影响目的:探讨骨化三醇补充对NAFLD患者氧化应激和胰岛素抵抗的影响。方法:共筛查91例NAFLD患者,纳入68例。根据血清25(OH)D3水平,将68例患者分为3组:维生素D缺乏组(n=28)、维生素D不足组(n=17)和维生素D正常组(n=23)。对维生素D缺乏组和不足组的NAFLD患者补充骨化三醇0.25 μg/d,随访12周。最终,有57名受试者完成研究并被纳入分析。比较骨化三醇补充前后的各项指标的变化。结果:维生素D缺乏组和不足组的NAFLD患者的超敏C反应蛋白、丙二醛(MDA)高于维生素D正常组,超氧化物歧化酶(SOD)低于维生素D正常组,校正混杂因素后,差异仍存在统计学意义(P<0.05);此外,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)同样显著高于维生素D正常组(P=0.035)。骨化三醇干预后,维生素D缺乏组和不足组NAFLD患者的hs-CRP、MDA水平显著下降(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05),脂肪肝指数(FLI)下降(P<0.05),但骨化三醇干预前后的HOMA-IR无明显改变(P>0.05)。结论:骨化三醇可改善维生素D缺乏和不足NAFLD患者的氧化应激反应,但对胰岛素抵抗无明显影响。