论文部分内容阅读
研究背景和目的:寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种通过蚊虫叮咬传播的单股正链RNA病毒。由于ZIKV感染与成人严重的神经系统并发症和新生儿的小头畸形密切相关,引起了全世界的关注。但是,ZIKV的致病机制仍未完全阐明,目前尚无针对该病毒的特异性抗病毒药物及疫苗。因此,深入研究ZIKV的致病机制以及与宿主的相互作用,对于预防ZIKV感染以及开发新的抗病毒策略具有重要意义。microRNA（miRNA）是一类在转录后水平调节基因表达的小型非编码RNA。miRNA在病毒感染以及相关疾病的调控中具有广泛的作用。已有的研究显示,ZIKV感染后会引起宿主细胞miRNAs表达失调,但miRNA如何调控ZIKV病毒复制及其作用机制却鲜有报道。本研究旨在筛选ZIKV感染前后差异表达的miRNAs,并对ZIKV感染后表达显著升高的一个miRNA（miR-103a-3p）展开深入研究,探究其对ZIKV复制的影响及其作用机制。研究方法:1.使用小分子RNA测序技术（sRNA-seq）,筛选ZIKV感染后表达显著改变的miRNAs。在A549细胞和SH-SY5Y细胞中,通过qPCR进一步验证3个上调和3个下调的miRNA的表达。将这6个已验证的miRNA的模拟物（mimic）分别转染至A549细胞中,再用ZIKV感染,qPCR检测ZIKV NS5 mRNA的表达,明确它们对ZIKV复制的影响。2.将 miR-103a-3p mimic 或 inhibitor 转染至 A549、THP-1、2fTGH 或 U5A 细胞中,再用ZIKV感染这些细胞,研究miR-103a-3p表达水平的改变对ZIKV复制和ERK、JNK及p38 MAPK磷酸化水平的影响。采用SP600125、SB203580处理或p38αsiRNA转染A549细胞后,再用ZIKV感染,探讨阻断JNK或p38 MAPK信号通路对ZIKV复制的影响。使用四种生物信息学软件（miRanda、Targetscan、miRmap和picTar）对miR-103a-3p可能作用的靶基因进行预测,通过双荧光素酶报告基因实验对靶基因OTUD4进行验证。将OTUD4质粒或siRNA转染至A549细胞,再用ZIKV感染,探究OTUD4高表达或沉默对ZIKV复制和p38 MAPK信号通路的影响。qPCR检测ZIKV NS5 mRNA的表达,Western blot检测ZIKV NS 1蛋白的表达和ERK、JNK、p38 MAPK及HSP27的磷酸化水平。3.转染OTUD4质粒至A549或293T细胞,感染ZIKV病毒或用IFNβ刺激后,通过qPCR、Western blot和双荧光素报告基因实验检测OTUD4高表达对IFNβ表达、STAT1/STAT2的磷酸化水平、ISRE活性、ISGs的表达及ZIKV复制的影响。通过免疫共沉淀筛选与内源性OTUD4相互作用的ZIKV病毒蛋白。在A549或293T细胞中转染ZIKV NS5质粒,IFNβ刺激后,检测NS5高表达对ISRE活性和ISGs的表达的影响。此外,OTUD4质粒或siRNA与ZIKV NS5质粒共转,再用IFNβ刺激,检测OTUD4高表达或沉默对NS5高表达调控ISGs表达的影响。研究结果:1.sRNA-seq筛选出了 35个ZIKV感染前后显著差异表达的miRNAs（p＜0.05）,其中15个上调,20个下调,且qPCR验证结果与测序结果一致。miR-4454和miR-493-3p高表达显著抑制ZIKV复制,miR-409-3p和miR-103a-3p高表达显著促进ZIKV复制,但miR-1246和miR-210-3p高表达对ZIKV复制没有显著影响。2.miR-103a-3p高表达促进ZIKV复制,miR-103a-3p抑制剂抑制ZIKV复制,但对ZIKV入胞没有显著影响。miR-103a-3p高表达促进JNK和p38 MAPK的磷酸化水平,但不影响ERK的磷酸化水平。JNK抑制剂SP600125显著抑制ZIKV复制,但不影响miR-103a-3p对ZIKV复制的促进作用,提示miR-103a-3p不通过JNK信号通路调控ZIKV复制。p38α沉默或p38 MAPK抑制剂SB203580处理均能显著抑制ZIKV复制,且SB203580处理后的细胞中,miR-103a-3p高表达对ZIKV复制的促进作用被显著抑制,提示miR-103a-3p通过p38 MAPK信号通路调控ZIKV的复制。通过四种不同的生物信息学软件预测miR-103a-3p潜在的靶基因共有177个,经文献检索发现,OTUD4与病毒感染及p38 MAPK信号通路有关,双荧光报告基因实验证实OTUD4是miR-103a-3p直接作用的靶基因之一。OTUD4高表达抑制ZIKV复制和p38 MAPK信号通路,而敲低OTUD4促进ZIKV复制以及激活p38 MAPK信号通路。OTUD4高表达抑制miR-103a-3p对ZIKV复制的促进作用和对p38 MAPK信号通路的激活。但OTUD4不完全依赖p38 MAPK信号通路调控ZIKV复制。3.OTUD4高表达促进IFNβ的表达、STAT1/STAT2的磷酸化水平、ISRE的活性以及ISGs的表达,增强IFNβ对ZIKV复制的抑制作用。且OTUD4能够与ZIKV NS5蛋白相互作用进而减弱NS5对ISGs的抑制作用。结论:1.通过sRNA-seq我们获得了 35个ZIKV感染前后miRNAs的差异表达谱,其中miR-103a-3p在ZIKV感染后表达显著上调,且miR-103a-3p高表达后显著促进ZIKV复制。2.miR-103a-3p通过靶向OTUD4激活p38 MAPK信号通路促进ZIKV复制。3.OTUD4高表达通过促进Ⅰ型干扰素（IFN-I）信号传导抑制ZIKV复制,且通过与ZIKV NS5结合,减弱NS5对IFN-I信号通路的抑制作用。