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Part Ⅰ:TNF-α 预处理 hUCMSCs-Exos 通过 hsa-miR-299-3p 抑制巨噬细胞高尔基体上NLRP3蛋白的激活一、研究目的本研究首先明确TNF-α预处理人脐带间充质干细胞来源的外泌体(T-Exo)与未处理hUCMSCs来源的外泌体(Exo)相比,对LPS诱导的小鼠巨噬细胞中过度活化的NLRP3炎症小体复合物及其下游过度表达的炎症因子的抑制作用,并初步探究了其作用的分子机制,为急性肝衰竭治疗提供新的潜在思路。二、研究方法1.收集TNF-α预处理3天后的hUCMSCs培养上清液并提取外泌体,通过Western blot和流式细胞仪分析外泌体特征标记蛋白,纳米粒子示踪法检测外泌体浓度和粒径,透射电子显微镜观察典型的外泌体形状,未经TNF-α预处理的hUCMSCs外泌体作为对照。2.用PKH67荧光染料标记外泌体,观察巨噬细胞对外泌体的摄取情况;并通过CCK-8实验测定Exo与T-Exo对巨噬细胞增殖的影响。3.LPS刺激巨噬细胞构建体外炎症模型,用Exo与T-Exo进行处理,收集细胞培养上清液及细胞总蛋白,通过ELISA检测细胞培养上清中促炎细胞因子的浓度,并通过Western blot检测巨噬细胞中NLRP3通路相关蛋白的表达情况。4.进行初步的机制探究,通过q-PCR实验进一步观察T-Exo中抗炎相关miRNA的表达情况并推测其对NLRP3通路激活的影响。三、研究结果1.Exo与T-Exo处理不影响巨噬细胞的增殖;巨噬细胞+LPS组中,NLRP3,Caspase-1和ASC蛋白表达水平明显升高,促炎细胞因子IL-1β,IL-6和IL-18分泌增加;巨噬细胞+LPS+Exo组与巨噬细胞+LPS+T-Exo组相比巨噬细胞+LPS 组中 NLRP3,Caspase-1 和 ASC 的表达降低,IL-1β,IL-6 和 IL-18 的分泌减少;其中巨噬细胞+LPS+T-Exo组抑炎效果更显著。2.q-PCR实验表明,与未经处理的hUCMSCs外泌体相比,相关抗炎hsa-miR-299-3p在TNF-α刺激的脐带间充质干细胞外泌体中显著上调,差异具有统计学意义,P<0.05;并在T-Exo与巨噬细胞共孵育后部分地转移到巨噬细胞中。3.T-Exo,NLRP3蛋白和巨噬细胞反式高尔基体网络结构(TGN)之间的共定位情况:未经处理的对照组TGN结构完整,NLRP3未激活;在LPS刺激下,NLRP3被激活,TGN分解为分散的反式高尔基体网络结构(dTGN),在Merge图上观察到了 NLRP3和dTGN的共定位;而T-Exo处理组的巨噬细胞TGN的结构几乎完整。表明TNF-α预处理外泌体可以显著抑制TGN上炎症小体NLRP3的募集与激活。四、研究结论TNF-α预处理hUCMSCs外泌体可降低LPS诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体复合物的过度活化及细胞上清液中促炎细胞因子的表达水平。Part Ⅱ:TNF-α预处理hUCMSCs外泌体对急性肝衰竭小鼠模型的肝脏保护作用一、研究目的通过体内实验进一步验证T-Exo可以抑制急性肝衰竭小鼠肝脏中NLRP3炎症小体复合物的活化以及外周血血清中炎症因子的表达。阐明TNF-α预处理hUCMSCs来源外泌体在缓解急性肝衰竭中的意义及潜在的机制。二、研究方法1.构建急性肝衰竭小鼠模型:24只C57BL/6雄性小鼠随机分为4组:对照组(CON);模型组(ALF):LPS(5mg/kg)+D-GalN(150mg/kg);模型+Exo对照治疗组;模型+T-Exo治疗组。对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,尾静脉注射等体积PBS缓冲液;模型组,模型+Exo对照治疗组和模型+T-Exo治疗组均给予腹腔注射LPS(5mg/kg)+D-GalN(150mg/kg)1h后尾静脉分别给予同体积PBS缓冲液,Exo悬液(100μg/250ul)及T-Exo悬液(100μg/250ul)。2.收集小鼠肝脏,称重,观察HW/BW系数,采用HE染色评估肝脏的损伤与炎症程度。3.ELISA、偶联酶测定法分别测定天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)的表达情况。4.通过Western blot检测肝组织中NLRP3,Caspase-1和ASC蛋白的表达水平;免疫组化再次检测肝组织中NLRP3和Caspase-1蛋白的表达水平。5.收集小鼠外周血血清,ELISA法测定血清中促炎细胞因子的表达水平。三、研究结果1.肝组织病理变化:对照组无变化;模型组炎性细胞渗出,肝细胞坏死;模型+Exo对照治疗组与模型+T-Exo治疗组肝组织损伤减轻,炎性渗出减少;模型+T-Exo组与模型+Exo组相比具有更明显的治疗效果。2.肝组织中NLRP3,Caspase-1和ASC蛋白表达量在模型组中最高,模型+T-Exo组较模型组及模型+Exo组明显减低。3.肝组织中AST、ALT表达水平在模型组最高,模型+T-Exo组较模型组及模型+Exo组明显减低;血清中IL-1β,IL-6和IL-18表达水平在模型组最高,模型+T-Exo组与模型+Exo组明显减低,与模型+Exo组相比,模型+T-Exo组具有更明显的治疗效果。差异均具有统计学意义(P<0.05)。四、研究结论尾静脉注射TNF-α预处理hUCMSCs来源的外泌体可以抑制小鼠肝脏中NLRP3炎症小体复合物的表达,从而缓解LPS+D-GalN诱导的小鼠急性肝衰竭。