2810430M08Rik是近年来小鼠基因组研究中新发现的一个分布和功能未知的基因.2810430M08Rik的eDNA序列与其他己知基因没有任何显著的同源性,它所编码的约281氨基酸长的蛋白质,也不含有任何己证实功能的结构域.目前为止,还没有任何有关此基因产物分布或功能的报道.在对T淋巴细胞活化机制的前期研究中发现,当细胞发生活化后2810430M08Rik基因的表达可发生上调,提示此新基因可能参与T淋巴细胞的活化,并与T淋巴细胞免疫反应中的某些功能有关.本课题以2810430M08Rik基因产物在小鼠组织中的特异性分布以及在T淋巴细胞发育、活化和相关免疫反应中的作用为主要研究对象,力求揭开此未知基因的神秘面纱. 第一部分：281043OM08Rik基因的组织特异性表达及在T淋巴细胞免疫反应中的作用 目的： (1)验证2810430M08Rik基因在T淋巴细胞活化过程中的表达变化. (2)观察2810430M08R8ik基因转录产物在C57BL/6J小鼠个体发育过程中的表达模式,分析其在小鼠胚胎期、新生期及成年期各阶段的组织和细胞特异性分布特征. (3)评估2810430M08Rik基因的高表达是否影响小鼠主要系统的一般情况. (4)评估并分析2810430M08Rik基因的高表达对T淋巴细胞发育、活化和T淋巴细胞免疫反应的相关方面是否存在影响,并探讨可能的机制. 方法： (1)Nonhem blot测定2810430M08Rik mRNA的表达水平. (2) In situ hybridization 分析 2810430M08Rik mRNA 的分布情况. (3) 构建2810430M08Rik重组质粒,使用显微注射技术建立转基因小鼠,并用 Southern blot、PCR 及 Real-time RT-PCR进行鉴定. (4) 大体水平观察转基因鼠外观和活动、饮食和排泄、生物节律和繁殖,以及主要脏器外观和重量等一般情况. (5) 使用同位素[<3>H]标记的胸腺嘧啶摄取率测定、流式细胞学测定、ELISA、化学趋化实验、迟发型超敏反应模型等分别测定转基因小鼠T淋巴细胞发育、活化的情况和其体内外功能的主要方面,评估T淋巴细胞免疫反应性. 结论： (1) 2810430M08Rik 基因在小鼠个体发育过程中具有独特的组织特异性表达模式,这是今后深入研究不可缺少的重要工具. (2) 2810430M08Rik 基因在 T 淋巴细胞活化时发生表达上调,但目的基因的高表达并不能显著影响T淋巴细胞的发育、活化和T淋巴细胞免疫反应. (3) 2810430M08Rik 基因对免疫系统的其他方面,或在其他系统和组织中的发育和功能,以及在病理条件下的作用还有待进一步深入探索.蛋白酶体作为真核细胞内蛋白质降解的核心场所,承担着细胞内80～90﹪蛋白质的降解,对维持内环境稳定和调控细胞生长代谢具有重要的意义.蛋白酶体抑制剂是一系列小分子化合物,能通过多种途径选择性的抑制蛋白酶体的水解活性,并因其显著的抗肿瘤作用而广收关注.越来越多的实验资料表明,蛋白酶体抑制剂除能作用于恶性组织细胞外,还能影响正常组织细胞的多种生理病理过程. Ps-341是首支应用于临床抗肿瘤治疗的硼肽类蛋白酶体抑制剂,本篇研究观察PS-341对心肌和血管平滑肌组织蛋白酶体活性的作用,并主要探讨其对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响,为探索蛋白酶体抑制剂应用于心血管病防治打下初步的理论基础,具一定的临床指导意义. 第二部分:蛋白酶体抑制剂--PS-341能有效抑制血管平滑肌细胞增殖并促进其凋亡 目的： (1)观察PS-341对心肌和血管平滑肌组织特异性蛋白酶体活性的抑制效果. (2)观察PS-341对离体培养的平滑肌细胞增殖率的影响. (3)观察PS-341对离体培养的平滑肌细胞凋亡率的影响,并对作用机制进行初步研究. (4)观察PS-341对由TNF-α引起的平滑肌细胞NF-кB活化的影响. 方法： (1)分别提取C57BL/6J小鼠的新鲜心肌和主动脉中层组织,观察蛋白粗体物对底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC的水解能力,评估蛋白酶体的糜蛋白酶样活性. (2)提取小鼠主动脉平滑肌细胞进行体外培养,通过[<3>H]标记的胸腺嘧啶摄取率实验测定平滑肌细胞的增殖水平. (3)采用流式细胞学技术测定主动脉平滑肌细胞凋亡的水平,并用实时定量荧光RT-PCR和Western印迹分析某些促/抗凋亡因子的含量变化. (4)采用Western印迹观察平滑肌细胞胞浆IκB-α和核内NF-κB水平变化. 结论： 在心血管系统,PS-341能有效抑制心肌和血管平滑肌蛋白酶体的水解活性,在低浓度下能剂量依赖性的抑制平滑肌细胞增殖,并在稍高浓度时促进平滑肌细胞凋亡.在细胞凋亡机制的研究中发现,虽然PS-341能下调抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和Flip的基因转录的水平,但对效应蛋白的含量并无显著影响,同时对NF-κB的活化转位也无明显抑制.因此,蛋白酶体抑制剂除能影响肿瘤细胞的生长和功能,也能对正常的血管平滑肌细胞产生作用.PS-341作为目前最为成熟的蛋白酶体抑制剂,与其他类型蛋白酶体抑制剂相比,在对平滑肌细胞的效应和作用机制上也具有自身的特点.