【摘 要】
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研究目的原发性肝癌是全球范围内多发性的恶性肿瘤之一,其所造成的死亡率在我国位居第二位,晚期肝癌是一种较难治愈的癌症,以往缺乏有效的治疗手段,传统的系统性化疗效果不佳,而且患者逐渐产生了耐药性,为了进一步治疗肝癌,迫切需要找到新的治疗靶点。KDM1A是第一个被发现的赖氨酸去甲基化酶,它通过去除底物的甲基化修饰对底物实现调控,以往的研究中发现它与BCL2的表达呈相关性。FKBP8作为FKBP家族的肽脯
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研究目的原发性肝癌是全球范围内多发性的恶性肿瘤之一,其所造成的死亡率在我国位居第二位,晚期肝癌是一种较难治愈的癌症,以往缺乏有效的治疗手段,传统的系统性化疗效果不佳,而且患者逐渐产生了耐药性,为了进一步治疗肝癌,迫切需要找到新的治疗靶点。KDM1A是第一个被发现的赖氨酸去甲基化酶,它通过去除底物的甲基化修饰对底物实现调控,以往的研究中发现它与BCL2的表达呈相关性。FKBP8作为FKBP家族的肽脯氨酰顺反异构酶,可以通过调控BCL2和BCL2L1抵抗凋亡。KDM1A主要分布在细胞核中,有关其细胞质功能的研究较少,本研究旨在对KDM1A本身核质分布、KDM1A如何调节BCL2/BCL2L1以及肝癌细胞凋亡的机制进行初探,以便为临床上肝癌细胞的耐药性提供新的理论基础。研究方法1.通过使用慢病毒表达sh RNA的方法,将HLF细胞中的KDM1A和FKBP8敲低,检测细胞的增殖水平。2.采用免疫沉淀和质谱的方法,在293T细胞中验证KDM1A能否被KAT8乙酰化。3.运用免疫荧光、核浆分抽和放线菌酮的方法,在293T和HLF细胞中,检测乙酰化的KDM1A细胞定位和稳定性。4.运用免疫共沉淀和GST pulldown的方法,验证KDM1A和FKBP8之间是否存在相互作用。5.运用免疫沉淀、GST pulldown的方法,检测FKBP8是否被甲基化以及KDM1A是否可以去除FKBP8的甲基化。6.采用免疫亲和纯化和体外孵育方法,WB检测与Ca M结合的FKBP8的甲基化水平。7.采用慢病毒表达sh RNA的方法,将HLF细胞中的FKBP8敲低后又恢复,并施加化疗药物,检测细胞的增殖情况。8.采用慢病毒表达sh RNA的方法,将HLF细胞中的KDM1A敲低或用药物抑制后又过表达FKBP8,并施加化疗药物,检测抗凋亡指标以及细胞的增殖情况。实验结果1.通过TCGA数据库分析以及将HLF细胞中的KDM1A和FKBP8敲低后发现,KDM1A和FKBP8在肝癌中的表达与预后相关,并且是细胞增殖所必需的。2.将KDM1A和HAT共转,免疫沉淀和质谱结果表明KAT8能将KDM1A乙酰化,乙酰化位点是K117。3.在293T和HLF细胞中过表达KDM1A的野生型和突变型,结果表明KDM1A的K117乙酰化使部分KDM1A出核而且使细胞中的KDM1A水平提高。放线菌酮实验结果表明,细胞质中的KDM1A稳定性比细胞核中的高。4.过表达KDM1A和FKBP8,免疫共沉淀、GST pulldown结果显示KDM1A和FKBP8之间存在相互作用。5.免疫沉淀、GST pulldown结果表明SMYD3能够将FKBP8的K377进行甲基化修饰,而且乙酰化的KDM1A可将FKBP8去甲基化。6.免疫亲和纯化的FLAG-Ca M与部分甲基化的FKBP8孵育后,FLAG抗体免疫沉淀,WB检测结果发现与Ca M结合的FKBP8的甲基化水平低于未结合的。7.在FKBP8敲低的HLF细胞中,细胞对化疗药物更敏感,而过表达FKBP8-K377R的细胞要比过表达FKBP8-WT的细胞对化疗药物的耐受性强。8.在HLF细胞中,将KDM1A抑制后,BCL2/BCL2L1的水平和线粒体定位减少,而FKBP8过表达后可逆转这一现象。MTT检测发现采用化疗药物处理细胞后,将KDM1A抑制后,细胞的增殖明显变慢,而过表达FKBP8后,细胞的增殖部分回升。结论1.KDM1A的K117乙酰化影响KDM1A的定位,使得细胞质中的KDM1A水平升高,细胞质中的KDM1A稳定性高于细胞核中的,从而使得KDM1A总蛋白升高。2.KDM1A可能通过调节FKBP8的甲基化从而提高BCL2/BCL2L1的表达和线粒体定位,进而抑制肝癌细胞的凋亡。3.抑制KDM1A-FKBP8-BCL2/BCL2L1轴能够影响肝癌细胞的生长以及对抗癌药物的敏感性。
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