第一部分MicroRNA-21-5p靶向调控丝裂原活化蛋白激酶激酶3目的验证MicroRNA-21-5p（miR-21-5p）与丝裂原活化蛋白激酶激酶3（MKK3）3’非编码区（3’UTR）结合，证实miR-21-5p与MKK3的靶向调控关系。方法1、分别构建MKK33’UTR报告载体（MKK3-3U）及MKK33’UTR突变报告载体（MKK3-3U-M）；化学合成miR-21-5p模拟物（mimics）、miR-21-5p抑制剂（inhibitor）及无意义miR (NC)。2、分别用NC（NC1组）、mimics（mimic1组）、inhibitor（inhibitor1组）与MKK3-3U共转染人胚肾（HEK293）细胞，双荧光素酶检测仪检测细胞荧光比值。3、分别用空载质粒（pYr-MirTarge）（对照组）、MKK3-3U（Wt组）、MKK3-3U-M（Mut组）与mimics共转染HEK293，双荧光素酶检测仪检测细胞荧光比值。4、NC（NC2组）、mimics（mimic2组）、inhibitor（inhibitor2组）分别干预人肾小管上皮（HK-2）细胞；采用反转录PCR、Western blot方法检测各组HK-2细胞中MKK3的mRNA及蛋白表达水平。结果1、NC1组、mimic1组、inhibitor1组荧光比值分别为100%、67.99%、133.17%。mimic1组与NC1组比较，差异有显著性（P<0.01）。证实了miR-21-5p能与MKK33’UTR靶向结合。2、对照组、Wt组、Mut组荧光比值分别为100%、65.3%、98.48%，Wt组与对照组比较，差异有显著性（P<0.01），而Mut组、对照组间荧光比值差异无显著性（P>0.05）。证实了miR-21-5p不能与突变的MKK33’UTR结合。3、NC2组、mimic2组、inhibitor2组，MKK3mRNA相对表达量为1.36±0.02、1.01±0.04、1.43±0.06（P<0.01）；蛋白质相对表达量为0.97±0.05,0.62±0.06、1.36±0.32（P<0.01）；mimic2组、NC2组间MKK3的mRNA和蛋白质表达水平均明显降低（P<0.05）。证实miR-21-5p在mRNA及蛋白水平低调MKK3。结论MKK3是miR-21-5p的靶基因，miR-21-5p在mRNA和蛋白质水平调控MKK3表达，提示miR-21-5p可能是调控p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路的重要分子。第二部分缺血再灌注肾损伤模型小鼠肾脏miR-21/丝裂原活化蛋白激酶激酶3/白介素-6及肿瘤坏死因子-α的表达及意义目的探讨缺血再灌注肾损伤模型小鼠肾脏miR-21、MKK3及下游白介素-6（IL-6）/肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达及意义。方法1、实验分组：将雄性57BL/6J小鼠随机分为3大组：对照组（C组）、假手术组（S组）、缺血再灌注组（IR组），除C组外，其余两组根据再灌注时间点分别分为9个亚组，即再灌注后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d；2、动物模型：采用夹闭双侧肾蒂30min后再灌注的方法，建立缺血再灌注肾损伤模型；假手术组只暴露双侧肾蒂，不进行夹闭。3、实验方法：全自动生化检测仪检测各组小鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平；HE染色观察肾脏病理损害，肾小管间质病理损害评分法计量小鼠肾脏病理损害程度；实时定量RT-PCR法检测肾组织miR-21表达水平；RT-PCR、免疫组织化学染色方法检测肾组织MKK3、IL-6、TNF-α表达。结果1、肾功能变化及肾脏病理评分：IR组缺血再灌注后Scr、BUN、肾脏病理损害及肾小管间质病理评分逐渐加重，24h达到最高峰，之后逐渐下降，各个时间点亚组差异具有显著性（P<0.01）。2、肾脏miR-21的表达变化：IR组再灌注后肾脏miR-21表达水平逐渐上升，12h至24h上升最快，24h达峰值，为基线值的286.0倍，并稳定维持在此高水平。3、MKK3表达变化：IR组小鼠肾组织MKK3mRNA和蛋白质表达水平在再灌注后逐渐上升，24h达到最高值，之后逐渐下降。4、肾脏IL-6、TNF-α表达变化：IR组小鼠肾脏IL-6mRNA和蛋白质表达水平在缺血再灌注后急剧上升，再灌注6h达到高峰，然后逐渐下降。IR组小鼠肾脏缺血再灌注后TNF-α mRNA表达水平逐渐上升，于再灌注后24h达峰值；与mRNA的表达趋势不同的是：IR组缺血再灌注后TNF-α蛋白表达逐渐上升，再灌注48h达到高峰，48h至72h保持高值，之后逐渐下降。结论MiR-21及丝裂原活化蛋白通路及下游炎症因子—白介素-6/肿瘤坏死因子-α与缺血再灌注肾损伤密切相关，miR-21及MKK3及下游因子—IL-6/TNF-α在缺血再灌注肾脏损伤过程中起着重要作用。第三部分肾脏缺血预处理上调miR-21低调丝裂原活化蛋白激酶激酶3及下游白介素-6/肿瘤坏死因子-α保护肾脏目的探讨miR-21介导丝裂原活化蛋白激酶激酶3低调白介素6/肿瘤坏死因子-α对肾脏的保护作用。方法1、实验分组：将雄性C57BL/6J小鼠随机分为3大组：缺血再灌注组（IR组）、缺血预处理再灌注组（IPC+IR组）、假缺血预处理再灌注组（S+IR组），各组根据再灌注时间点分别分为9个亚组，即再灌注后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d；2、动物模型：（1）缺血再灌注肾损伤模型：采用夹闭双侧肾蒂30min后再灌注方法，建立缺血再灌注肾损伤模型；（2）缺血预处理模型：首先行双侧肾蒂夹闭15min钟再灌注，4d后采取夹闭双侧肾蒂30min后再灌注建立模型；（3）假缺血预处理模型：首先行游离双侧肾蒂但不夹闭，4d后采取夹闭双侧肾蒂30min后再灌注建立模型；3、实验方法：全自动生化分析仪检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；HE染色观察肾脏病理损害情况，肾小管间质病理评分计量肾脏病理损害程度；实时定量RT-PCR方法检测肾组织miR-21表达水平；RT-PCR、免疫组织化学染色方法检测肾组织MKK3、IL-6、TNF-α表达。结果1、肾功能的变化及肾脏病理评分：（1）肾功能：IR组再灌注后Scr、BUN逐渐加重，于24h达最高峰，之后逐渐下降；IPC+IR组再灌注后Scr、BUN、肾脏病理损伤的变化趋势与IR组一致，但损伤程度较IR组明显减轻；（2）肾脏病理评分：IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的肾小管间质病理评分（分）分别为：1.00±0.12v0.30±0.11、1.50±0.15v1.50±0.15、2.00±0.15v1.30±0.16、2.60±0.23v1.5±0.16、3.80±0.22v1.70±0.12、3.10±0.24v1.30±0.13、2.50±0.12v1.30±0.11、2.30±0.24v1.00±0.11、1.60±0.11v0.50±0.07，在每一个时间点两组间的肾小管间质病理损害评分均有显著差异（P<0.01）。2、肾脏miR-21的表达变化：IR组再灌注24h，肾脏miR-21达峰值，为基线值的286.0倍，之后维持高值；而IPC+IR组再灌注0h，肾脏miR-21即达峰值，为基线值的286.0倍，并一直维持在此高峰值。3、MKK3的表达变化：IR组MKK3mRNA和蛋白质表达在再灌注后逐渐上升，24h达到最高值，之后逐渐下降；IPC+IR组MKK3mRNA和蛋白质的变化趋势与IR组一致，但表达水平明显低于IR组。IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的MKK3mRNA的水平分别为：0.89±0.10v0.51±0.06；1.45±0.13v0.52±0.07；1.65±0.18v0.54±0.09；2.15±0.22v0.61±0.11；3.19±0.31v0.81±0.09；2.66±0.28v0.76±0.10；1.87±0.22v0.68±0.08；1.68±0.15v0.66±0.07；1.62±0.17v0.63±0.08；MKK3蛋白质的水平(OD/10000）分别为：15.51±1.56v14.36±1.51；34.24±2.82v21.14±1.67；71.54±5.43v31.52±2.01；145.16±8.29v45.39±2.03；159.50±7.32v60.34±3.67；209.74±8.13v95.12±4.02；95.58±5.47v62.13±2.31；87.32±5.12v42.51±2.57；45.13±3.25v33.18±1.99。IR组与IPC+IR组相比较，两组在再灌注3h~7d各个相同时间点亚组MKK3mRNA及蛋白质表达差异均具有显著性（P<0.05）。4、IL-6和TNF-α表达变化：（1）IR组IL-6mRNA和蛋白质表达在缺血再灌注后急剧上升，再灌注6h达到高峰，然后逐渐下降，而IPC+IR组IL-6mRNA和蛋白质一直保持较低水平表达。IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的IL-6mRNA水平分别为：0.65±0.11v0.30±0.07；1.53±0.14v0.39±0.05；2.82±0.24v0.43±0.07；2.21±0.26v0.41±0.09；1.73±0.21v0.44±0.09；1.55±0.18v0.46±0.07；1.38±0.14v0.43±0.06；1.16±0.08v0.41±0.06；0.89±0.06v0.40±0.05；IL-6蛋白质的水平(OD/10000）分别为：45.22±1.58v35.16±2.53；68.13±2.72v42.73±1.99；135.28±8.42v58.33±2.23；108.99±5.49v50.11±2.41；91.18±6.32v47.29±4.12；72.63±5.15v46.63±3.87；66.57±4.47v43.18±2.67；58.74±5.82v40.12±2.85；46.33±2.27v36.47±1.82。IR组与IPC+IR组相比较，两组在再灌注3h~5d各个相同时间点亚组IL-6mRNA表达差异均具有显著性（P<0.05）；IL-6蛋白质表达在0h~7d各个相同时间点亚组差异均具有显著性（P<0.01）。（2）IR组缺血再灌注后TNF-α mRNA表达逐渐上升，于再灌注后24h达峰值，之后逐渐下降；缺血预处理后，小鼠肾脏TNF-α mRNA的变化趋势与IR组一致，但其各个时间点的表达水平一直较IR组低；与mRNA的表达趋势不同的是：IR组缺血再灌注后TNF-α蛋白表达逐渐上升，再灌注后48h达到高值，48h至72h保持高值，之后逐渐下降；缺血预处理后，小鼠肾脏TNF-α蛋白质的变化趋势与IR组一致，但在各个时间点的表达水平一直较IR组低。IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的TNF-α mRNA水平分别为：0.80±0.20v0.50±0.07；1.66±0.21v0.51±0.11；2.02±0.26v0.50±0.09；2.63±0.31v0.54±0.09；3.57±0.42v0.54±0.12；2.82±0.47v0.55±0.15；2.19±0.32v0.52±0.16；1.73±0.22v0.52±0.14；1.12±0.17v0.50±0.09；TNF-α蛋白质的水平(OD/10000）分别为：63.67±3.56v62.31±4.22；82.36±5.82v66.47±4.41；97.23±6.43v70.39±4.57；106.67±6.29v77.12±4.63；124.37±7.32v81.36±4.74；167.53±7.23v91.16±5.01；158.36±5.43v81.82±4.45；98.42±5.22v70.11±4.87；82.31±3.17v65.35±4.39。IR组与IPC+IR组相比较，两组在再灌注3h~5d各个相同时间点亚组TNF-α mRNA表达差异均具有显著性（P<0.05）；TNF-α蛋白质表达在0h~7d各个相同时间点亚组差异均具有显著性（P<0.01）。结论缺血预处理对小鼠AKI肾脏具有保护作用，这种保护作用可能与肾脏IPC促进miR-21表达，进一步低调MKK3，抑制p38MAPK通路下游因子IL-6、TNF-α表达有关。