论文部分内容阅读
蘑菇褐变是影响蘑菇采后品质劣变的一个重要因素。巨大口蘑在8℃~12℃条件下,能贮藏30 d不变色,有着独特的不易褐变特性。本研究基于高通量二代和三代结合的测序技术,获得的巨大口蘑单核菌丝A6的全基因组序列和经亚铁离子胁迫巨大口蘑褐变的重组转录本以及表达谱,利用PCR和实时荧光定量PCR技术从分子水平分析亚铁离子胁迫巨大口蘑褐变的机理,利用生物信息学知识和技术解释巨大口蘑抗褐变的内在可能因素。具体结果如下:1.获得A6 27.97Mb的全基因组序列,并对数据质量进行评估,分析了基因组特征,并以circo图呈现了scaffold、GC%、测序深度、基因表达量以及旁系同源基因共线性等特征,数据组装的质量较高。2.A6全基因组与双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、双色蜡蘑(Laccaria bicolor)全基因组进行比较基因组分析,同样以circo图描绘出相互之间直系同源基因的共线性关系,结果显示,巨大口蘑和双孢蘑菇在基因大小、基因数量上比较相似,为物种间的耐贮藏特征差异研究提供理论依据。3.以A6基因组为参考基因组对本实验室前期测得的亚铁离子胁迫处理巨大口蘑(FK)转录本和非亚铁离子胁迫处理巨大口蘑(CK)转录本重新注释,分析其差异表达基因,并富集到KEGG,然后筛选出与褐变有关的通路(黑色素合成通路),并结合表达谱测序结果,通过热图和细胞图呈现变化过程。4.基于本实验室通过酶活性测定认为酪氨酸酶与亚铁离子胁迫巨大口蘑褐变有关的研究结果,于A6基因组进行本地BLAST分析,获得3条酪氨酸酶基因序列:GME158、GME6843和GME7523。5.通过PCR自8个常用的真菌基因表达分析内参基因中选出6个有扩增条带为候选内参基因(α-Actin、NADH、RPB、60s、β-Tubulin和GAPDH),然后通过实时荧光定量PCR测定了该6个基因在不同生长阶段、不同组织以及不同浓度的亚铁离子处理的巨大口蘑子实体中的Ct值,同时利用三种常用的软件(GeNorm、NormFinder和Bestkeeper)评估了其扩增效率,确定β-tubulin为巨大口蘑基因表达分析的最佳内参基因。6.以β-tubulin为内参基因,通过实时荧光定量PCR对7个褐变相关代谢过程中酪氨酸酶等33个基因进行了表达分析,结合转录本中代谢通路的预测分析,其中24个基因的表达与转录本中的变化趋势相同,与黑色素合成直接相关的仅有酪氨酸酶基因,在RNA水平上验证了亚铁离子胁迫下巨大口蘑褐变的原因主要是酪氨酸酶基因中GME7523表达水平的显著上升。7.通过PCR自巨大口蘑营养体DNA扩增了GME158、GME6843和GME7523,以其测序序列预测了蛋白序列GME158p、GME6843p和GME7523p,并通过生物信息学软件工具对3个预测蛋白的理化性质及二维结构进行分析,结果表明GME6843有信号肽为分泌蛋白,GME158和GME6843均存在可跨膜结构。然后通过PCR在巨大口蘑营养体cDNA中扩增出了基因GME7523转录的3条不同序列GME7523-1、GME7523-2和GME7523-3,对比基因组序列发现GME7523存在可变剪接。以上结果表明,亚铁离子胁迫巨大口蘑褐变的关键因素是酪氨酸酶基因的表达量上调,而巨大口蘑抗褐变的原因很可能是酪氨酸酶基因功能位点的缺失。本论文首次利用生物信息学手段对褐变机制进行研究,并且发现了巨大口蘑中酪氨酸酶与双孢蘑菇中酪氨酸酶序列的关键差异,为今后酪氨酸酶基因表达机制的研究提供了理论依据。