【研究背景及目的】肝损伤是各种肝病共同的病理基础。目前研究认为，炎症反应是肝损伤和肝病慢性化至关重要的因素。肝细胞是肝脏最主要的细胞成分。急、慢性肝损伤的炎症反应及修复过程中均有肝细胞参与。另外，肝细胞表面存在许多炎症因子的受体，如白介素（Interleukin）受体、肿瘤坏死因子α（TNF-α）受体和转化生长因子（TGF-β）受体等，表明肝细胞在肝脏的炎症反应中发挥重要作用。肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factors, HNFs）是一组在肝脏中大量表达，并发挥重要作用的转录因子。其中，肝细胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor1α，HNF1α）是肝细胞核因子家族（HNFS）的主要成员之一。它可促进肝细胞分化，在肝脏发育中发挥重要作用，并在分化成熟的肝细胞中高表达，维持肝细胞的生物学功能。既往研究表明，肝脏发生急性炎症时，HNF1α可通过促进C-反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）的表达参与肝脏急性炎症反应的调节及修复。此外，炎症因子白介素-6（interlukin-6，IL-6）可显著抑制肝脏HNF1α的表达及转录激活活性，提示HNF1α可能参与调节肝脏的炎症反应及肝纤维化的发生和发展。微小RNA（microRNA，miRNA）广泛分布于线虫、果蝇和人类多种组织细胞内，是一类含21-25个核苷酸的单链非编码RNA。miRNA可通过靶向结合于mRNA的3′非翻译区，负向调控相应的蛋白表达。既往有诸多研究表明miRNA与炎症关系密切。它们主要通过靶向作用于炎症相关通路如NF-κB和JAK-STAT等通路上的重要蛋白起到促进或抑制炎症反应的作用。miR-21是目前研究较多的炎症相关的miRNA之一。既往有研究报道miR-21可靶向作用于HNF家族的重要成员HNF4α，而我们的前期研究表明HNF4α在肝纤维化过程中表达下调，上调其表达可抑制肝纤维化进展。以上研究提示炎症相关的miRNA可能与HNF1α在肝纤维化炎症反应过程的作用有关。基于以上研究背景，本研究旨在探明肝细胞炎症反应过程中HNF1α表达的变化，以及其表达变化对肝细胞炎症反应的影响，并进一步探讨HNF1α表达下调过程中miRNA可能发挥的作用，确定炎症相关miRNA-HNF1α调控轴在肝细胞炎症反应中的作用，为慢性肝病的防治提供新的思路及策略。【实验方法】一、肝细胞炎症反应过程中HNF1α表达情况（一）原代肝细胞培养过程中HNF1α及炎症因子表达的变化分离正常SD大鼠原代肝细胞并体外培养，收取第1、3、5、7天细胞RNA及蛋白，Real-time PCR检测TNF-α、IL-6mRNA表达，Western Blot检测各组HNF1α蛋白表达。（二）DMN模型大鼠原代肝细胞中HNF1α及炎症因子表达变化正常雄性SD大鼠，腹腔注射1％二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）溶液（100μl/100g体重），每周注射3次，一共注射2周，观察动物状态。采用改良后的Seglen两步胶原酶灌注法分离DMN造模第0周及第2周的SD大鼠原代肝细胞，采用Real-time PCR、Western Blot方法检测肝细胞中HNF1α及相关炎症因子的表达。二、构建重组复制缺陷型腺病毒AdshHNF1α按照本实验室既往的腺病毒构建方法，构建针对HNF1α的小干扰RNA表达载体（AdshHNF1α）。将构建的AdshHNF1α体外感染分离出的SD大鼠原代肝细胞，采用Real-time PCR和Western Blot法检测HNF1α表达水平，验证病毒构建是否成功。三、下调HNF1α表达对肝细胞炎症反应的影响（一）HNF1α表达下降在体外对肝细胞炎症因子表达的影响分离正常SD大鼠原代肝细胞并体外培养，24h后以感染复数（Multiplicity ofinfection，MOI）10感染AdshHNF1α，Western Blot方法检测第12h、24h以及36h肝细胞中HNF1α表达情况，Real-time PCR检测相关炎症因子表达水平。（二）HNF1α表达下降在体内对肝细胞炎症因子表达的影响正常SD大鼠经尾静脉注射AdshHNF1α或对照病毒AdshNC，2×109空斑形成单位（Plaque forming units，Pfu）/只，每周2次，注射3周后处死，留取肝脏组织，抽提肝组织RNA，采用Real-time PCR检测IL-6、TNF-α的mRNA表达水平。利用免疫组织化学方法检测肝细胞内HNF1α表达情况。四、miRNA-HNF1α调控轴对肝细胞炎症反应的调控（一）炎症相关miRNA对HNF1α表达的影响通过软件预测筛选与HNF1α3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）有结合位点的炎症相关miRNA。同上法分离原代大鼠肝细胞，细胞贴壁后，利用lipo2000分别转染miR-21、miR-31和miR-146a的拟似物（miRNA mimic），48小时后收集细胞，抽提RNA及蛋白，Real-time PCR检测HNF1α mRNA表达，Western Blot检测HNF1α蛋白表达。（二）验证HNF1α为炎症相关miRNA的靶基因构建HNF1α3′UTR荧光素酶报告基因质粒。利用lipo2000共转染miR-21mimic或miR-146a mimic和荧光素酶报告基因质粒，使用双报告基因检测试剂盒检测miR-21或miR-146a报告基因活性，验证HNF1α是否为miR-21和miR-146a靶基因。（三）炎症因子刺激对炎症相关miRNA及HNF1α表达的影响分离SD大鼠原代肝细胞，全血清培养2d后，换成含有50ng/ml IL-6或20ng/mlTNF-α的无血清培养基继续培养；抽取培养48h后细胞的总RNA和蛋白。采用Western blot法检测HNF1α表达，Real-time PCR技术检测HNF1α及miR-21、miR-146a的表达情况。（四）DMN、BDL模型大鼠中HNF1α、miR-21和miR-146a表达的相关性参照本实验室方法制备胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)大鼠肝纤维化模型。分别于注射DMN及行BDL术2周后处死大鼠，抽提肝脏组织RNA。Real-time PCR检测肝组织中HNF1α、miR-21和miR-146a的表达，评价其表达相关性。五、统计学分析数据采用SPSS11.0统计软件包进行分析，方差齐性选择t检验进行分析，方差非齐性就选择非参数检验进行分析；P <0.05时，可认为具有显著性差异，P <0.01时则判定为具有非常显著性差异。【实验结果】一、在肝细胞的炎症反应过程中HNF1α表达下降（一）原代肝细胞培养过程中HNF1α表达逐渐下降，炎症因子表达上升大鼠原代肝细胞体外培养，Real-time PCR检测结果显示：随着培养时间的延长，HNF1α表达逐渐下降，而炎症因子IL-6、TNF-α的mRNA表达逐渐升高。（二）DMN模型大鼠原代肝细胞中HNF1α表达下降，炎症因子表达上升大鼠腹腔注射DMN造模成功后，分离DMN造模第0及第2周大鼠原代肝细胞，抽提RNA及蛋白，结果显示与正常大鼠肝细胞相比，DMN造模第2周肝细胞中HNF1α mRNA及蛋白水平显著下降，IL-6、TNF-α细胞因子mRNA水平明显上升（P<0.05）。二、下调HNF1α表达在体内外均可诱发肝细胞炎症反应（一）HNF1α表达下降在体外对肝细胞炎症因子表达的影响分离正常SD大鼠原代肝细胞并体外培养，24h后以MOI10感染AdshHNF1α，Western Blot检测第12h、24h、36h肝细胞中HNF1α表达情况，Real-time PCR检测炎症因子表达水平。结果显示与AdshNC相比，AdshHNF1α可显著下调肝细胞中HNF1α表达，上调肝细胞中IL-6、TNF-α的表达（P<0.05）。（二）HNF1α表达下降在体内对肝细胞炎症因子表达的影响正常SD大鼠经尾静脉注射AdshHNF1α2周后处死，留取肝脏组织。免疫组化结果显示注射AdshHNF1α后，肝组织内HNF1α表达显著降低。Real-time PCR结果显示与AdshNC组相比，AdshHNF1α组IL-6及TNF-α表达显著升高。三、miRNA-HNF1α调控轴在肝细胞炎症反应中的作用（一）炎症相关miRNA可下调HNF1α表达查阅文献中与炎症相关的miRNA，利用软件预测筛选其中与HNF1α3′UTR有结合位点的miRNA，确定下一步继续研究的miRNA为miR-21、miR-31和miR-146a。分离原代大鼠肝细胞，转染miR-21、miR-31和miR-146a的拟似物（miRNA mimic），48小时后收取细胞RNA及蛋白，检测HNF1α的mRNA及蛋白表达水平。结果显示，miR-21和miR-146a可显著下调HNF1α mRNA及蛋白表达。（二）验证HNF1α为炎症相关miRNA的靶基因293细胞共转染miR-21mimic或miR-146a mimic和HNF1α3′UTR荧光素酶报告基因质粒，双报告基因实验结果显示miR-21mimic和miR-146a mimic均可使报告基因活性显著下调，提示HNF1α为miR-21和miR-146a靶基因。（三）炎症因子刺激肝细胞后炎症相关性miRNA表达升高，HNF1α表达下降分离SD大鼠原代肝细胞，全血清培养2d后，换成含有50ng/ml IL-6或20ng/mlTNF-α的无血清培养基继续培养；于48h收集细胞RNA及蛋白。Western blot法检测HNF1α表达，Real-time PCR检测HNF1α及miR-21、miR-146a的表达情况。结果显示经IL-6及TNF-α分别刺激后，肝细胞中HNF1α蛋白表达下降，IL-6及TNF-α中和抗体可部分回复HNF1α蛋白表达。同时Real-time PCR结果提示，IL-6和TNF-α刺激后，肝细胞中miR-21和miR-146a表达升高，HNF1α表达下降。（四）DMN、BDL模型大鼠肝脏中miR-21、miR-146a和HNF1α表达的相关性分别于注射DMN及行BDL术2周后处死大鼠，收取肝脏组织RNA。Real-timePCR及相关性分析结果显示DMN和BDL模型大鼠肝脏中miR-21表达与HNF1α呈负相关，miR-146a表达与HNF1α亦呈负相关。【结论】一、肝细胞炎症反应过程中HNF1α表达下降。二、下调HNF1α表达在体内外均可诱发肝细胞炎症反应。三、HNF1α是miR-21和miR-146a的直接靶基因。四、miRNA-HNF1α调控轴参与调控肝细胞炎症反应。