食管癌是世界常见恶性肿瘤之一,每年新增病例约40万~50万例,其中大约50%左右的病例发生在中国。河北省磁县是中国的食管癌高发区,食管癌的患病率与死亡率居全省恶性肿瘤的首位,严重威胁人类的健康。显著的地域性分布差异(高、低发区发病率相差500倍)和家族聚集性现象是高发区食管癌的流行病学特征。提示环境因素和遗传因素可能均在食管癌发生过程中起重要作用。MicroRNAs(mi RNAs)是一类高度保守的、大约有23个核苷酸的、内源性非编码小分子RNA,广泛存在于人类及其它真核生物体内。mi RNAs可作为癌基因或抑癌基因,通过与其靶基因、上游转录因子及各种反馈调控回路等相互交织组成复杂的生物调控网络,参与肿瘤的发生、发展,为肿瘤的诊断和治疗提供新的靶点。研究发现mi R-196与多种肿瘤发生及预后相关,以癌基因或抑癌基因发挥作用。miR-196在食管癌中高表达,表明它作为癌基因参与肿瘤的发生发展。存在于mi R-196a-2基因上的T/C多态(rs11614913),能够引起pre-miR196a2茎区G:C到G:T的改变,可能会影响pre-miR-196a-2变成成熟体的过程或影响该miRNA的靶点识别,并且具有组织特异性。同时,mi R196a2作为一个内源性mi RNA基因,拥有自己的启动子区。存在于mi R-196a-2基因启动子区的功能性多态rs35010275有可能影响基因的表达水平,携带GG基因型能够上调胃癌患者的癌组织或者癌旁正常组织的mi R-196a-2的表达水平。mi R-196a的候选靶基因包括HOX家族,HMGA2,ANXA1和p27kip1等。研究发现,miR-196可通过抑制HOXB8的蛋白表达,促进HL60细胞向髓细胞分化;通过下调p27kip1的表达促进胃癌细胞和宫颈癌细胞的增殖;另外,细胞学研究发现,miR-196a表达水平增高能够导致ANXA1表达下调,而ANXA1表达的抑制或缺失与食管癌的发生有关。本研究首先应用PCR-LDR技术检测并探讨mi R-196a-2基因rs11614913t/c多态、rs35010275g/c多态与中国食管癌高发区磁县人群食管癌发生和预后的关系;其次,采用qrt-pcr技术检测了mir-196a基因及其靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8在食管癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中的表达情况。深入分析了mir-196a基因及其靶基因表达水平之间的关系。再次,进行mir-196a基因的过表达或抑制,并通过mtt实验、划痕实验和transwell实验研究mir-196a对食管癌细胞株eca109细胞和kyse30细胞增殖、迁移和侵袭的影响。第一部分mir-196a-2基因多态性与escc遗传易感性及预后的关联研究目的:探讨mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp和rs35010275c/gsnp与食管癌高发区磁县人群escc遗传易感性及预后的关系,以寻找高发区人群escc发病风险的分子标志物。方法:本研究共包括597例食管癌患者和597名健康对照个体。食管癌患者是2006年~2012年在磁县经内镜普查、并经当地医院组织学检查确诊为食管鳞状细胞癌的门诊或住院病人。健康对照为同时间、同地区内镜普查无上消化道肿瘤的正常无关个体。调查并记录escc患者及健康对照个体的年龄、性别、吸烟状况及家族史等情况。将性别、年龄等与食管癌发生有关的影响因素作为匹配条件,最终选取597名健康个体作为对照。吸烟或者曾吸烟每日5支及以上,并持续至少两年者定义为吸烟个体。至少1名一级亲属和/或至少2名二级亲属患食管癌/贲门癌/胃癌的个体,则定义为具有上消化道肿瘤(uppergastrointestinalcancers,ugic)家族史。采用pcr-ldr方法对mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp和rs35010275c/gsnp进行基因分型。结果:1escc患者组ugic家族史阳性个体比例为47.6%,显著高于健康对照组(38.4%)(χ2=10.34,p<0.01),表明ugic家族史可显著增加escc的发病风险,经性别、年龄校正后的or值为1.46(95%ci=1.16~1.84)。2在健康对照组中mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp基因型分布符合hardy-weinberg平衡(χ2=0.001,p=0.97)。escc患者组的cc、ct、tt基因型频率分别为21.5%、51.4%、27.1%,与健康对照组的基因型频率(24.3%、49.9%、25.8%)相比,差异无统计学意义(χ2=1.40,p=0.50)。与cc基因型相比,携带ct、tt、ct/tt基因型均未增加escc的发病风险,校正后的or值分别为1.17(95%ci=0.88~1.56)、1.20(95%ci=0.86~1.66)和1.18(95%ci=0.90~1.55)。分层分析显示,与cc基因型相比,携带tt/ct基因型可能增加≤60岁的个体escc的发病风险(or=1.56,95%ci,1.08~2.26),但未能增加>60岁个体escc的发病风险(or=0.82,95%ci,0.55~1.23)。基因-年龄之间的交互作用发现,mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp与年龄之间存在交互作用,表明患者发病年龄越早,遗传倾向在其中的作用就越大。3mir-196a-2基因启动子区rs35010275g/csnp基因型分布在健康对照组中符合hardy-weinberg平衡(χ2=0.04,p=0.83)。健康对照组及escc患者组的gg、gc、cc基因型频率分别为49.1%、42.2%、8.7%和52.9%、40.9%、6.2%。rs35010275多态的基因型频率总体分布在健康对照组及escc患者组之间差异无统计学意义(p>0.05)。与gg基因型相比,携带gc、cc、gc/cc基因型未改变escc的发病风险,校正后or值分别为0.90(95%ci=0.71-1.14)、0.67(95%ci=0.42~1.05)和0.86(95%ci=0.68~1.08)。分层分析发现,与gg基因型或gc/gg基因型相比,携带cc基因型能够降低≤60岁的个体escc的发病风险,or值分别为0.49(95%ci=0.26-0.92)和0.51(0.28-0.93)。4未发现mir-196a-2基因的rs11614913多态与rs35010275多态与escc的预后的关系。结论:1mir196a2基因rs11614913c/tsnp的t等位基因能够增加≤60岁年龄组人群escc的发病风险。2mir196a2基因启动子区的rs35010275多态的c等位基因是≤60岁年龄组人群escc的发病的保护因素。第二部分mir-196a及其靶基因在食管癌组织中的表达及相关性分析目的:通过检测mir-196a基因及anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8等靶基因在食管癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中的表达情况,以及分析mir-196a与候选靶基因之间的相关性,探讨mir-196a基因及其靶基因在食管癌发生过程可能发挥的作用。方法:收集河北医科大学第四医院胸外科2012年9月至2013年3月食管癌根治性手术切除标本28例。采用qrt-pcr技术检测mir-196a基因及其靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8在食管癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中的表达。另外,分析了mir-196a表达与候选靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8表达水平的相关性。结果:1mir-196a在癌旁组织和癌组织中的表达上调率分别是64.29%(18/28)和100%(28/28)。mir-196a在正常黏膜组织、癌旁组织和癌组织中的表达水平差异有统计学意义(χ2=42.07,p<0.001)。组间两两比较发现,癌组织中mir-196a的表达水平显著高于正常黏膜组织和癌旁组织。2靶基因anxa1,p27kip1和hoxb8的表达水平在正常黏膜组织、癌旁组织和癌组织中的表达水平差异有统计学意义(p值均<0.001)。组间两两比较发现,癌组织中anxa1,p27kip1和hoxb8的表达水平显著低于正常黏膜组织和癌旁组织。hoxc8的表达水平在正常黏膜组织、癌旁组织和癌组织中的表达水平差异无统计学意义(χ2=0.29,p=0.87)。3mir-196a及其候选靶基因anxa1和p27kip1、hoxc8和hoxb8的正常黏膜组织和癌旁组织间、正常黏膜组织和癌组织之间、癌旁组织与癌组织之间的表达水平呈正相关(r=0.80,p<0.001)。4mir-196a与候选靶基因anxa1、p27kip1和hoxb8之间的表达呈显著负相关(p值均<0.001),anxa1、p27kip1和hoxb8的表达水平随mir-196a的表达升高而下降。结论:1mir-196a在食管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织和正常黏膜组织;候选靶基因hoxb8、p27kip1和anxa1的表达水平显著低于癌旁组织和正常黏膜组织;hoxc8的表达水平与escc的发生无关。2mir-196a的表达水平与候选靶基因hoxc8、hoxb8、p27kip1和anxa1的表达水平之间存在显著负相关,表明mir-196a可能通过抑制靶基因anxa1、hoxb8和p27kip1的表达而发挥癌基因的作用。第三部分mir-196a对食管癌细胞生物学行为及靶基因表达水平的影响目的:探讨mir-196a在食管癌中的功能及其发挥功能的机制。方法:转染mir-196amimic或mir-196ainhibitor及negativecontrol,通过qrt-pcr的方法检测mir-196a及其靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8的表达水平,对组织学的实验结果进行验证;并通过mmt实验、划痕实验和transwell实验研究mir-196a对食管癌细胞株eca109和kyse30增殖、迁移和侵袭的影响。结果:1人食管癌细胞株eca109转染mir-196amimic或inhibitor后,mir-196amimic转染组中mir-196a的表达水平较阴性对照组显著增高(约14.45倍,p<0.01);mir-196ainhibitor转染组中mir-196a的表达水平较阴性对照组显著降低(降低约29%,p<0.01)。靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8的表达差异均无统计学意义(p>0.05)。2人食管癌细胞株kyse30转染mir-196amimic或inhibitor后,mir-196amimic转染组中mir-196a的表达水平较阴性对照组显著增高(约55.48倍,p<0.01),靶基因hoxb8的表达显著降低,差异有统计学意义;mir-196ainhibitor转染组中mir-196a的表达水平较阴性对照组显著降低(降低约31%,p=0.04),hoxb8的表达水平显著升高,差异有统计学意义(p<0.05)。3mtt细胞增殖实验显示,eca109细胞转染0h、24h、48h、72h和96h后,mir-196amimic组相对于阴性对照组的细胞存活率为:100%,103%,112%,117%和111%,过表达组与阴性对照组相比,细胞增殖差异有统计学意义(f=5952.77,p<0.001);eca109细胞转染0h、24h、48h、72h和96h后,mir-196ainhibitor组相对于阴性对照组的细胞存活率为:99%,87%,91%,87%和87%,两组之间细胞增殖的差异有统计学意义(f=6622.80,p<0.001)。对人食管癌细胞株kyse30的作用与eca109细胞相同。4对人食管癌细胞株eca109和kyse30的划痕实验结果显示,与阴性对照组相比,mir-196amimic转染组24h后划痕愈合比例增加,mir-196ainhibitor转染组划痕愈合比例降低,差异均有统计学意义(p<0.05);transwell小室侵袭实验结果显示,mir-196amimic转染组24h后每个视野下穿过细胞数增加,mir-196ainhibitor转染组穿过细胞数减少,差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:1人食管癌细胞株Eca109转染miR-196a mimic后,miR-196a的表达上调;转染miR-196a inhibitor后,mi R-196a的表达下调;未见其靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8的异常表达。2人食管癌细胞株KYSE30转染mi R-196a mimic后,mi R-196a的表达水平显著升高,其靶基因HOXB8的表达下降;转染miR-196a inhibitor后,mi R-196a的表达水平显著下降,其靶基因HOXB8的表达升高。3 MTT实验显示,过表达或抑制miR-196a后,均可促进或抑制人食管癌细胞株Eca109细胞和KYSE30细胞的增殖。4 Transwell侵袭小室实验和细胞划痕实验显示,过表达或抑制mi R-196a对人食管癌细胞株Eca109和KYSE30细胞的迁移、侵袭能力有显著影响。