一、研究目的骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种常见的骨科慢性疾病,其主要特征是关节软骨退行性变,发病率亦逐年增加,但目前尚无阻止骨关节炎不可逆进展的有效治疗方法。以纳米材料为载体的骨关节炎药物关节腔内注射（Intra-articular,IA）模型给药模式已被广泛应用于骨关节炎治疗的科学探究中,是实现骨关节炎药物控释和靶向治疗的一种有效途径。本研究通过合成比表面积大、能够高效负载药物、特异性靶向病变胶原蛋白、生物相容性好且能够自行降解的多功能生物活性靶向纳米酶系统（C-178@m SMW）,为骨关节炎的治疗提供新的研究支撑,为临床转化提供理论依据。二、方法及结果第一章:多功能生物活性靶向纳米酶复合物系统的合成及表征相关研究研究方法:通过油水两相合成法合成介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporous silica nanoparticles,MSNs）,在其表面通过共沉淀法原位生长纳米酶二氧化锰合成二氧化锰包裹MSNs（Mn O2@MSNs,m SM）。通过扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察MSNs和m SM纳米材料形貌和大小;其结构和物相通过X射线衍射法（X-ray Polycrystalline diffraction,XRD）来确定,使用纳米粒度及Zeta电位分析仪（Dynamic Light Scattering,DLS）检测MSNs和m SM纳米材料的粒径和表面电荷;使用元素mapping分析O和Mn元素分布情况;比表面积及孔径分析仪（BET测试）检测比表面积和孔径分布;然后,在Mn O2的表面修饰羧基-COOH,与II型胶原靶向肽（Collagen II-targeting peptide,WYRGRL）中的氨基进行连接,超声进一步将STING抑制剂C-178负载至MSNs的介孔中,合成C-178@m SMW;使用纳米粒度及Zeta电位分析仪（Dynamic Light Scattering,DLS）检测粒径和表面电荷;通过红外光谱表征WYRGRL和C-178修饰和负载成功;将m SMW纳米材料放置于不同的溶液[dd H2O、PBS缓冲液和细胞培养基（Cell medium）]中进行培养,在不同时间（12、24和48h）点后,采用DLS粒径分析仪检测材料稳定性;通过对活性氧（Reactive oxygen species,ROS）响应检测MSNs和m SM纳米材料清除ROS的能力;紫外吸收光谱检测m SMW纳米材料负载C-178的负载率;透析法检测m SMW纳米材料对C-178的累积释放量。TEM电镜检测m SMW纳米材料可降解性能。结果:合成的MSNs的直径在100 nm左右,粒径大小均一,分散度好,呈介孔圆球状,孔道均匀（～7 nm）,比表面积（760 m~2/g）大,Zeta电位为-31.1 m V。SEM和TEM检测到在MSNs表面生长了Mn O2,呈现花粉状结构,粒径均在130 nm左右,Zeta电位为17.4 m V,mapping元素显示O和Mn元素均匀分布在MSNs表面,而m SM纳米材料与MSNs纳米材料相比,比表面积（680 m~2/g）和孔径（～9 nm）没有发生明显变化;电位、粒径和红外光谱明确WYRGRL和C-178修饰成功,且形貌未发生变化;DLS显示m SMW纳米材料在dd H2O、PBS缓冲液和细胞培养基中培养高达48 h后粒径未发生显著变化,表明合成的纳米材料具有良好的稳定性。m SM纳米材料与MSNs相比能够更多的清除ROS;MSNs对C-178的负载量达到了41.61 mg/g,而m SMW负载C-178的负载量为38.32 mg/g,MSNs的表面修饰并没有影响其对C-178负载量的改变,且m SMW起到了缓慢释放C-178的作用。第二章:多功能生物活性靶向纳米酶复合物系统的生物学性能及抗炎性能的体外实验研究第一部分C-178@m SMW载药纳米酶复合物的生物学性能相关研究研究方法:酶消化法提取新生大鼠膝关节软骨细胞,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定;CCK-8检测不同浓度（5、10、25、50、100和200μg/m L）的m SMW纳米材料对原代提取的软骨细胞的毒性影响;采用溶血活性实验检测材料的血液生物相容性;通过激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）检测不同浓度（0、25、50、100μg/m L）的材料（FITC探针修饰）与软骨细胞孵育6 h后被软骨细胞摄取情况。结果:倒置显微镜下观察到成功提取了新生大鼠的原代软骨细胞,形态呈现小而圆型。静置后,绝大部分细胞呈现贴壁依赖性,增大且形成突起。早期软骨细胞呈圆形和多边形,椭圆形的核位于胞体中间。甲苯胺蓝染色显示原代软骨细胞为单层细胞,细胞形态呈多角形,细胞质呈蓝紫色阳性。CCK-8显示当m SMW浓度达到200μg/m L,孵育72小时细胞活力依旧在80%以上;溶血实验也显示,m SMW材料浓度达到200μg/m L,对溶血率依旧没有显著影响。进一步说明m SMW材料在浓度达到200μg/m L时没有明显的细胞毒性,说明具有良好的生物相容性。CLSM显示与m SM纳米材料相比,随着浓度的增加,软骨细胞摄取m SMW材料的能力增加。第二部分C-178@m SMW载药纳米酶复合物系统抗炎性能的体外实验研究研究方法:10 ng/m L白介素-1β（IL-1β）处理软骨细胞24 h构建软骨细胞炎症状态模型模拟骨关节炎,酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的含量表达确定软骨细胞炎症状态模型构建成功;实时荧光定量PCR（RT-PCR）和免疫印迹（Western Blot）检测炎症状态中STING的m RNA和蛋白表达水平;构建si-STING和过表达质粒转染至软骨细胞炎症状态模型细胞中,RT-PCR验证转染效率;ELISA检测炎症因子含量以及Western Blot检测凋亡相关因子的蛋白表达水平;通过RT-PCR检测STING过表达及C-178处理对软骨细胞基质分子Aggrecan、Col2a1、MMP13和ADAMTS5的m RNA表达水平;ROS检测试剂盒检测在细胞层面MSNs和m SMW纳米材料（50μg/m L）清除ROS的能力;利用流式凋亡和Western Blot检测空白组、软骨细胞炎症状态模型组、造模+m SMW组、造模+C-178组、造模+C-178@m SMW组对软骨细胞凋亡的影响;RT-PCR和ELISA检测上述各组对软骨细胞炎性因子含量表达的影响及Aggrecan、Col2a1、MMP13和ADAMTS5的表达的影响。结果:IL-1、IL-6和TNF-α的含量高表达提示IL-1β诱导的软骨细胞炎症状态模型构建成功;RT-PCR和Western Blot结果显示STING在细胞炎症状态中显著上调;成功构建STING敲低和过表达细胞模型;si-STING抑制细胞炎症状态中炎症因子的含量以及凋亡水平,而STING过表达促进了细胞炎症状态中炎症因子的含量以及凋亡水平并促进了细胞外基质ECM的降解;加入STING抑制剂C-178后ECM降解得到抑制,表明C-178能够通过抑制STING的表达抑制软骨细胞炎症状态。根据第一部分的研究结果,本研究选择了m SMW浓度为50μg/m L进行软骨细胞炎症状态模型体外治疗研究。与MSNs纳米材料相比,m SMW纳米材料能够显著清除IL-1β诱导的ROS;流式凋亡显示IL-1β促进软骨细胞的凋亡,m SMW和C-178能够起到部分抗凋亡作用,而C-178@m SMW几乎抑制了IL-1β导致的细胞凋亡;Western Blot也证实了C-178@m SMW抗凋亡相对最为显著这一观点。RT-PCR和ELISA显示单独IL-1β处理后,IL-1、TNF-α、IL-6、MMP13和ADAMTS5的表达显著上调,而Aggrecan和Col2a1的m RNA表达显著下调。加入m SMW、C-178和C-178@m SMW后,IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP13、ADAMTS5的表达降低,Aggrecan、Col2a1的表达逐渐增加。C-178@m SMW组软骨细胞的抗分解代谢能力和抗炎更突出,说明C-178@m SMW对骨关节炎软骨细胞炎症状态的体外治疗效果好。第三章:多功能生物活性靶向纳米酶复合物系统治疗骨关节炎的体内实验研究研究方法:选择6-8周的SD大鼠作为实验动物,实验分为5组（每组3只）:1)Sham组;2)DMM造模膝关节退变组;3)DMM+m SMW组;4)DMM+C-178组;5)DMM+C-178@m SMW组。通过DMM手术横断大鼠膝关节内侧半月板胫骨韧带导致半月板失稳诱导骨关节炎的发生,一个半月后膝关节腔原位注射相应药物（20μL,50μg/m L）,连续6周,每4天注射一次,治疗后的第0、2、4、6周分别称SD大鼠体重,并在第6周治疗结束后安乐死处死大鼠,取膝关节组织进行Micro-CT扫描及骨组织形态学检测、苏木精-伊红染色（H＆E染色）、番红固绿（Safranin O＆fast green）染色、甲苯胺蓝染色、COL-I与COL-II免疫组化、ELISA及RT-PCR检测各组炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）和基质分子（MMP13,ADAMTS5,Aggrecan和Col2a1）的表达量来评估各组对骨关节炎的治疗效果,眼眶取血进行血常规和血生化检测（RBC、WBC、Platelets、Hemoglobin、ALT、AST）,及心肝脾肺肾等器官进行H＆E染色明确各组材料的体内生物安全性。应用SPSS16.0对上述各组的数据进行统计学分析。结果:治疗6周后,与Sham组相比,DMM组展现出明显的骨关节炎病理现象,包括骨质增生、骨赘形成、软骨剥脱、组织细胞增多、基质丢失等,而所有的治疗组中,DMM+C-178@m SMW组软骨表面损伤修复相对最有效,软骨结构相对最为完整,番红固绿染色相对最明显（红色）。免疫组化法检测显示Sham组软骨表面呈明显COL-I与COL-II阳性染色（深褐色）。相比之下,治疗后COL-I与COL-II阳性染色强度减弱,依次为DMM+C-178@m SMW组、DMM+C-178组和DMM+m SMW组。Micro-CT影像学分析显示DMM组与Sham组比较,DMM组软骨下骨骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）及骨小梁厚度（Tb.Th）均显著减少（P＜0.05）,骨小梁间隔（Th.Sp）增加;而治疗组BMD、BV/TV及Tb.Th均增加（增加强度依次为DMM+m SMW组、DMM+C-178组和DMM+C-178@m SMW组）,Th.Sp相反（P＜0.05）。RT-PCR及ELISA结果显示DMM组与Sham组比较,IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP13和ADAMTS5的表达显著上调,Aggrecan和Col2a1的表达显著下调,而治疗组的IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP13和ADAMTS5的表达被显著抑制,Aggrecan和Col2a1的表达显著上调,其中,DMM+C-178@m SMW组上述改变最为显著。第四章:多功能生物活性靶向纳米酶复合物治疗骨关节炎的分子机制实验研究研究方法:IL-1β处理软骨细胞构建软骨细胞炎症状态模型体外模拟骨关节炎,Western Blot检测NF-κB信号通路相关蛋白（p65和IκB）在软骨细胞炎症中的磷酸化水平;si-STING和STING过表达对软骨细胞炎症中NF-κB信号通路p65和IκB的磷酸化水平的影响;STING过表达再用C-178处理后进一步检测p65和IκB的磷酸化水平;使用si-p65下调软骨细胞炎症模型中的p65的表达,Western Blot检测Aggrecan、Col2a1、ADAMTS5和MMP13的蛋白表达水平明确NF-κB在STING介导的ECM调节中的作用;ELISA检测si-p65处理软骨细胞炎症模型后上清液中炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的含量,Western Blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3/caspase 3）的磷酸化表达明确NF-κB信号通路在STING诱导的炎症和软骨细胞凋亡中的作用。结果:在NF-κB信号通路中,IL-1β使得p65和IκB蛋白磷酸化被激活,STING过表达使得NF-κB信号通路的p65和IκB的磷酸化水平进一步显著上调,si-STING抑制p65和IκB的磷酸化水平,表明STING通过激活NF-κB信号通路的p65和IκB磷酸化水平参与软骨细胞炎症的进程;进一步在过表达STING的软骨细胞炎症模型中加入C-178处理抑制了p65和IκB的磷酸化水平,表明C-178通过抑制STING的表达进一步抑制了p65和IκB磷酸化的激活,从而抑制软骨细胞炎症;si-p65的加入显著逆转了STING过表达介导的Aggrecan和Col2a1蛋白表达的下调,以及ADAMTS5和MMP13的上调;表明STING通过NF-κB信号通路诱导ECM降解。si-p65显著降低了STING诱导的炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）和凋亡相关蛋白（Bax、cleaved caspase-3/caspase 3）的表达,并增加了Bcl-2的表达,C-178的加入进一步抑制了炎症因子（IL-1β,TNF-α,IL-6）和凋亡相关蛋白（Bax、cleaved caspase-3/caspase 3）的表达,和增加Bcl-2的表达水平;si-P65逆转了STING诱导的软骨细胞衰老和凋亡,表明STING通过NF-κB信号级联调控骨关节炎的炎症水平和软骨细胞凋亡。三、结论本研究成功合成了新型增强抗炎抗氧化、靶向软骨和药物缓释多重功能复合纳米酶系统（C-178@m SMW）用于治疗骨关节炎。实验结果表明,C-178@m SMW具有良好的释药效果。此外,还可通过纳米酶（Mn O2）来清除细胞自由基起到抗炎抗氧化的效果。重要的是,该纳米平台通过高效靶向递送C-178抑制STING的表达,从而抑制NF-κB信号通路的激活进一步缓解软骨细胞凋亡和炎症,抑制体内软骨变性。综上所述,该多功能纳米平台为骨关节炎的治疗开辟了一条新途径。