人角膜缘微环境细胞表达干细胞因子的体外研究

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【目的】探讨人角膜缘微环境细胞(LNCs)是否表达干细胞因子(SCF)及SCF在LNC细胞增殖过程中的作用。  【方法】采用组织切片免疫荧光染色检测人角膜缘组织中SCF及其受体C-kit的表达情况,其中以波形蛋白(vimentin)和pan cytokeratin(PCK)来区别基质及上皮组织。从人的角膜缘组织中分离培养人角膜缘微环境细胞(LNC),以人骨髓来源的间充质干细胞(BMMSCs)为对照,采用流式细胞技术和荧光定量实时PCR技术检测其CD90,CD105,CD73及SCF表达情况;采用免疫印迹技术检测SCF的表达量;采用免疫荧光技术检测SCF的表达部位。利用携带绿色荧光蛋白(GFP)的hSCF siRNA慢病毒载体,以不同感染复数(MOI)0,5,10,15,20,30,50感染LNC,荧光显微镜下观察GFP的表达情况,确定最佳感染复数(MOI)值。以最佳感染复数,采用携带GFP的慢病毒感染LNC做SCFsiRNA实验。实验分为3组,分别为:LNC空白组(CON组)、慢病毒感染LNC阴性对照组(NC组)、慢病毒感染LNC SCF siRNA组。采用荧光定量实时PCR(real-time PCR)和免疫印迹技术检测 SCF siRNA的沉默效率。并采用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测各组LNC增殖活性变化。  【结果】人角膜缘组织切片免疫荧光染色结果显示:SCF主要表达于PCK阳性细胞的基底层,其受体C-kit主要位于角膜缘组织的上皮层,而非基底层。流式细胞技术结果显示:96.73%的LNC表达CD90,88.71%的LNC表达CD105,95.02%的LNC表达CD73,11.06%的LNC表达SCF;而98.61%的BMMSC表达CD90,92.31%的BMMSC表达CD105,98.09%的BMMSC表达CD73,3.14%的BMMSC表达 SCF。荧光定量实时PCR结果从mRNA水平显示:LNC和BMMSC细胞内表达CD90,CD73,CD105和SCF的含量无明显差异,而LNC细胞中vimentin,SOX2和POU5F的mRNA含量明显高于BMMSC细胞。免疫印迹结果表明:LNC细胞中SCF的含量高于BMMSC。免疫荧光实验结果显示SCF主要表达于LNC和BMMSC的细胞膜和细胞质。携带绿色荧光蛋白(GFP)和hSCF siRNA的慢病毒,以不同感染复数感染LNC后,除MOI=0外其余MOI值条件下感染72h后LNC均有绿色荧光表达,但以MOI=5条件下LNC细胞生存状态良好,且随培养时间延长120h后LNC绿色荧光蛋白的表达率可达70-80%。CCK-8结果显示:LNC慢病毒感染阴性对照组的细胞存活率为71.9%,LNC慢病毒感染SCF siRNA B组的细胞存活率为24.9%。  【结论】人角膜缘微环境细胞(LNC)表达干细胞因子(SCF),并且SCF在LNC增殖过程中有重要作用。
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