黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的一类真菌毒素，具有较强致癌性，1993年被IARC列为“A级可能人类致癌物”。AF除了与肝癌发生密切相关外，呼吸道也是其重要致癌靶点。大量研究证实经呼吸道或经饮食途径摄入AF可以诱导肺癌的发生。我们以往研究发现，黄曲霉毒素G1（AFG1）是河北省南部肿瘤高发区日常食品主要污染的真菌毒素之一。长期口服AFG1可以诱导NIH小鼠发生肺腺癌，其肿瘤细胞来源于II型肺泡上皮细胞（AT-II）。外源性致癌物烟草、石棉通过诱导肺部慢性炎症导致肺癌发生，是目前比较公认的致癌途径之一。炎症反应长期迁延，在肺组织局部形成慢性炎症微环境，可以造成靶细胞DNA损伤、细胞突变、增殖以及血管增生等改变，从而促进靶细胞恶性增殖和肺癌的发生发展。大量文献报道AT-II是包括AFB1在内多种致癌物诱导肺腺癌的靶细胞，在肺癌发生中具有重要作用。肺组织炎症反应可以诱导AT-II与免疫调控相关表型发生改变，如上调MHC-II，增加COX-2表达，分泌免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β，进而诱导AT-II细胞发挥免疫抑制作用，刺激外周幼稚T细胞向调节性T细胞（Treg）分化，促进肺癌发生发展。此外，慢性炎症反应可能加剧了靶细胞中ROS的产生，诱导DNA损伤，在细胞癌变的启动阶段发挥重要作用。因此肺组织炎症微环境诱导AT-II细胞发生改变，可能在AFG1诱导肺腺癌发生中起重要作用。本研究室最近研究发现气管内一次性给予AFG1后，大鼠肺部出现一过性炎症改变和AT-Ⅱ细胞损伤。但是，AFG1是否能诱导慢性炎症产生，进而导致肺癌发生并未明了。如若AFG1诱导肺部慢性炎症反应，是否诱导AT-II细胞上与免疫调控相关的表型发生改变?是否诱导AT-II细胞发生氧化应激损伤尚不清楚。研究经口长期给予AFG1对肺组织炎症反应的影响，并探讨其对AT-II细胞的影响及机制，对揭示AFG1致肺癌机制具有重要意义。本研究旨在明确长期灌胃AFG1对肺部炎症反应的影响，及其在肺癌发生发展中的作用；探讨AFG1诱导的慢性炎症反应对AT-II细胞表型及功能的影响，以及对AT-II细胞氧化应激损伤的作用。本实验共分三部分，第一部分观察长期灌胃AFG1后，Balb/c小鼠肺部是否发生了慢性炎症反应，及其在肺癌发生中的作用；第二部分：体外培养具有人AT-II细胞特征的A549细胞和原代分离培养的人正常AT-II细胞，探讨AFG1对AT-II细胞表型成熟的影响；给予TNF-α和AFG1共同作用模拟AFG1诱导的慢性炎症反应，探讨其对A549细胞表型改变和细胞因子分泌功能的影响及机制；第三部分探讨TNF-a和AFG1共同作用，对A549细胞氧化应激损伤的影响及其可能作用机制。通过以上三个部分从体内到体外的研究，探讨AFG1致肺癌的可能作用及其作用机制，丰富人们对黄曲霉素致癌性的认识，为进一步做好食品卫生安全防控提供理论依据和合理处置位点。第一部分长期灌胃黄曲霉毒素G1诱导慢性肺部炎症并促进肺腺癌发生作用的研究目的：探讨长期灌胃黄曲霉毒素G1对Balb/c小鼠肺组织炎症反应的影响，及其在肺腺癌发生中的作用。方法：1按照我研究组前期灌胃AFG1诱导NIH小鼠肺腺癌的动物造模方法，经口给予Balb/c小鼠灌胃AFG16个月（每周3次），停止灌胃AFG1。2在灌胃1周和1、3、6个月后随机各取4只动物处死，采用常规HE染色和IHC染色观察小鼠肺组织炎症反应以及炎细胞浸润情况；以及炎症反应相关细胞因子和NF-κB和JAK/STAT3信号通路激活的情况。3采用荧光实时定量PCR（Real time PCR）、IHC染色和蛋白质免疫印迹（Western Blot）方法检测炎症模型小鼠肺组织中主要炎症相关细胞因子TNF-α的表达情况。4观察灌胃AFG1小鼠肺组织中II型肺泡上皮细胞增殖变化，以及血管生成情况。5采用IHC染色和Western Blot方法检测灌胃AFG1小鼠肺组织中氧化应激损伤标志蛋白SOD-2和HO-1表达情况；以及COX-2的表达情况。6其余动物在灌胃6个月后停止灌胃AFG1，继续饲养6个月，共1年后观察肺肿瘤发生情况以及炎症相关信号通路和COX-2的表达情况,进一步评估AFG1诱导肺组织炎症反应是否介导肺腺癌的发生。结果：1灌胃AFG1对Balb/c小鼠生物学行为的影响在AFG1灌胃、及灌胃后延长生存共12个月的观察期间，两组小鼠均无病亡，生长及生活状态无差异，均未出现临床疾病表现。2灌胃AFG1期间Balb/c小鼠肺部组织病理学改变随着AFG1灌胃时间延长，处理组小鼠较对照组小鼠出现明显的肺部慢性炎症反应，细胞增殖，3-6个月时达高峰。HE染色表现为：肺泡壁增厚，间隔增宽，出现炎症细胞浸润和肺泡上皮增生。IHC染色显示，浸润细胞以CD68＋的肺泡巨噬细胞和CD3＋的淋巴细胞为主，主要定位于肺泡囊壁部位。提示长期口服AFG1主要造成肺泡壁慢性炎症反应。3灌胃AFG1对Balb/c小鼠肺组织中主要炎症相关细胞因子和趋化因子表达水平的影响随着给药时间延长，处理组小鼠较对照组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1/CCL-2、MIP-2/CXCL-2、CXCL-1的mRNA表达水平增高（P<0.05），TNF-α在AFG1处理组小鼠肺组织切片的肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞中阳性表达，蛋白表达水平增高。4灌胃AFG1对Balb/c小鼠肺组织中NF-κB p65和STAT3信号通路的影响IHC染色显示，NF-κB p65和P-STAT3在AFG1处理组小鼠肺组织的肺泡上皮细胞和炎症浸润细胞核中的表达水平较对照组升高（P<0.05）。提示口服AFG1可以激活肺组织NF-κB p65和STAT3信号转导通路。5灌胃AFG1对Balb/c小鼠肺组织中氧化应激状态的影响IHC染色结果显示，AFG1处理组小鼠肺组织中氧化应激损伤标志蛋白SOD-2和HO-1阳性细胞较对照组明显增多。Western blot检测结果表明，AFG1处理组小鼠肺组织中SOD-2的蛋白表达水平较对照组升高（P<0.05）。提示口服AFG1可以诱导Balb/c小鼠肺组织中出现氧化应激损伤。6灌胃AFG1对Balb/c小鼠肺组织中细胞增殖和血管生成的影响IHC染色可见，AFG1处理组小鼠的肺组织中Ki67阳性细胞较对照组升高（P<0.05），且集中于肺泡壁和肺泡间隔部位，沿肺泡间隔走行；这些部位肺组织中SP-C阳性细胞数较对照组增多（P<0.05），与Ki67表达平行，增生细胞中未见CC-10阳性表达。提示AFG1可以诱导主要来源于AT-Ⅱ的细胞增殖。Western blot结果显示，AFG1处理组小鼠肺组织中VEGF的蛋白水平较对照组升高（P<0.05）。IHC染色可以观察到AFG1处理组小鼠的肺组织中VEGF阳性细胞较对照组增多。免疫荧光染色可见AFG1处理组小鼠肺组织中CD34表达较对照组升高。提示口服AFG1诱导的肺部慢性炎症组织中血管增生活跃，微血管密度增加。7灌胃AFG1对Balb/c小鼠肺泡上皮细胞中COX-2表达水平的影响IHC染色观察，可见AFG1处理组小鼠的肺泡上皮细胞中COX-2阳性表达细胞较对照组增多。Western Blot检测结果显示，AFG1处理组小鼠肺组织中COX-2的蛋白表达水平升高（P<0.05）。提示在AFG1诱导的肺部慢性炎症组织中，肺泡上皮细胞中的COX-2表达水平上调。8长期灌胃AFG1对Balb/c小鼠肺组织中炎症相关性肿瘤形成的影响连续给予AFG1处理6个月基础上，继续喂养6个月。12个月后，肺组织切片HE染色观察发现15只实验组小鼠中，8只小鼠肺组织出现肺泡上皮不典型增生病灶或肺腺癌（各4只），对照组中小鼠未见到不典型增生或肺腺癌。IHC染色显示，在不典型增生病灶和肺腺癌组织中，Ki67和SP-C阳性表达，CC-10未表达，提示AT-II细胞异常增殖参与肺腺癌的发生；IHC染色显示NF-κB p65、P-STAT3和COX-2在肺腺癌细胞中阳性表达。这些结果提示AFG1诱导慢性炎症反应可能在肺腺癌发生中起重要作用。第二部分黄曲霉素G1和肿瘤坏死因子α协同作用对肺泡Ⅱ型上皮细胞表型的影响及作用目的：炎症反应可以诱导AT-II表型发生改变：如上调MHC-II和COX-2表达，促进免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β分泌，进而诱导外周幼稚T淋巴细胞向调节性T细胞分化，抑制肺部免疫反应，促进肺癌发生发展。因为在第一部分中我们发现在AFG1灌胃小鼠肺组织中，COX-2在AT-II细胞中高表达，推测AFG1诱导慢性炎症反应可能诱导AT-II细胞表型改变而发挥免疫抑制作用。所以我们进一步在整体水平观察在AFG1诱导的肺慢性炎症反应和肺腺癌中AT-II细胞表型分子表达情况，及调节性T细胞的浸润情况，评估AT-II细胞表型改变与调节性T细胞浸润的关系。为了探讨AFG1诱导的肺慢性炎症反应影响AT-II细胞表型改变机制，我们给予AFG1和TNF-a共同作用A549细胞，体外模拟黄曲霉素G1诱导的慢性炎症反应，探讨AFG1和TNF-a对AT-Ⅱ细胞表型的影响及机制。方法：1采用第一部分的实验标本，IHC染色观察AFG1诱导的慢性肺炎和肺腺癌组织中MHC-II，CD74和FoxP3的表达情况，探讨AT-II细胞表型改变与调节性T细胞浸润的关系。2采用分离培养人AT-Ⅱ细胞和具有人AT-II特征的A549细胞，FCM方法检测其表面HLA-DR、CD80和CD86的表达情况，探讨AFG1单独作用对AT-II细胞表型成熟的影响。3在第一部分研究中，我们发现灌胃AFG1能上调炎症细胞因子的表达，TNF-α作为其中核心细胞因子，在mRNA和蛋白水平上表达明显增高，所以我们给予AFG1和TNF-α联合作用于A549细胞，检测其对A549细胞表面HLA-DR，CD54，COX-2表达的影响。4探讨p38和NF-κB通路在AFG1和TNF-α联合作用影响AT-II细胞表型改变中的作用。5采用Real-time PCR方法探讨AFG1和TNF-α联合作用对A549细胞中细胞因子表达的影响及可能机制。结果：1MHC-II，CD74和FoxP3在AFG1诱导的慢性肺炎和肺腺癌组织中的表达情况IHC染色观察，可见在AFG1诱导的慢性炎症肺组织和肺腺癌组织里，肺泡上皮细胞中IA/IE、CD74阳性细胞数增加，局部浸润淋巴细胞和邻近淋巴结中FoxP3表达增高。说明AFG1诱导慢性肺炎可能促进AT-Ⅱ细胞表面MHC-Ⅱ类分子高表达和肺组织Treg细胞浸润。结果提示AT-Ⅱ细胞上调MHC-II表达可能促进Treg细胞分化，在AFG1诱导的炎症相关的肺腺癌发生中发挥作用。2AFG1对A549细胞表型改变的影响及可能机制内吞实验表明，AFG1处理可以降低A549细胞吞噬能力，诱导AT-II细胞成熟。FCM检测结果表明，与溶剂对照组相比，AFG1处理后A549细胞表面HLA-DR、CD54表达明显增高（P<0.05），但是缺失CD80和CD86的表达。提示AFG1处理可能诱导AT-Ⅱ细胞表型成熟，发挥抗原递呈功能，但由于缺乏有效激活效应性T细胞所必需的共刺激因子表达，这种成熟AT-II细胞不能激活CD4+T细胞。p38信号通路可能在AFG1诱导AT-Ⅱ细胞表型成熟，上调HLA-DR和CD54表达中发挥调控作用。3AFG1对原代分离培养的AT-Ⅱ细胞表面HLA-DR、CD80和CD86表达的影响FCM检测结果显示，给予AFG1处理后，原代AT-Ⅱ细胞上HLA-DR的表达水平明显升高（P<0.05），而CD80和CD86仍缺失表达。实验结果进一步表明AFG1促进AT-II细胞表型成熟，但是缺乏CD86和CD80的表达，其在抗原递呈中不能激活CD4+T细胞。4AFG1+TNF-α联合作用对A549细胞HLA-DR和CD54表达的影响FCM检测结果显示，与AFG1单独处理组相比，AFG1+TNF-α联合作用明显增加了HLA-DR和CD54的表达（P<0.05）。提示在AFG1诱导的炎症微环境中，TNF-α可以与AFG1协同作用促进AT-Ⅱ细胞表型成熟。5AFG1和TNF-α协同作用引起A549细胞表型改变可能的机制Western Blot结果显示，AFG1和TNF-α共同作用可以提前激活p38信号通路（P<0.05），并激活NF-κB信号通路，但是AFG1单独作用不激活NF-κB通路。提示在AFG1诱导的炎症反应中，TNF-α激活NF-κB可能发挥重要作用。FCM结果表明，PDTC和SB203580预处理都可以抑制AFG1+TNF-α诱导产生的HLA-DR和CD54表达上调（P<0.05）。提示在AFG1诱导的慢性炎症微环境中，AFG1和TNF-α发挥协同作用激活p38通路，TNF-α单独激活NF-κB通路，共同调节AT-II细胞发生表型改变。6AFG1和TNF-α联合作用对A549细胞中COX-2表达的影响及可能途径Real-time PCR和Western Blot结果显示，单独给予TNF-α可以上调COX-2在mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05），单独给予AFG1对COX-2表达无影响，AFG1+TNF-α处理较单用TNF-α处理可以显著增加COX-2表达水平（P<0.05）。PDTC预处理抑制了COX-2的mRNA和蛋白表达上调（P<0.05），而SB203580预处理对COX-2表达无影响。在AFG1诱导的慢性炎症微环境中，TNF-α-NF-κB信号通路发挥核心作用，促进AT-II细胞高表达COX-2。7AFG1和TNF-α联合作用对A549细胞中细胞因子表达的影响及可能途径Real-time PCR结果显示，AFG1单独处理可以增加A549细胞中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和MCP-1的mRNA表达（P<0.05,Fig6A），而对MIP-2没有影响；AFG1+TNF-α明显发挥协同作用，进一步上调TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1和MIP-2的表达，其表达水平明显高于AFG1单独处理组（P<0.05, Fig7A）。提示AFG1和TNF-α发挥协同作用，诱导AT-Ⅱ细胞上调炎症相关细胞因子表达，而AFG1独自激活AT-II细胞上调TGF-β表达，参与肺部炎症反应或诱导免疫耐受。TNF-α单独激活NF-κB通路或和AFG1协同激活的p38通路共同发挥作用，调控AT-II细胞分泌炎症细胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1和MIP-2以及炎症抑制因子IL-10;但是TNF-α对AT-II细胞分泌TGF-β没有影响。而AFG1独自激活p38信号通路调控AT-II细胞表达TGF-β。提示AFG1诱导的慢性肺炎，可能通过激活NF-κB和p38信号通路诱导AT-Ⅱ细胞上调炎症相关细胞因子表达，促进肺部炎症反应和免疫耐受。AT-II细胞高表达IL-10和TGF-β，可能进一步支持表型改变的AT-II细胞促进Treg的活化。综合以上结果表明，在AFG1诱导的慢性炎症环境中，AT-Ⅱ细胞表型发生改变：HLA-DR、CD54和COX-2表达上调，免疫抑制性细胞因子TGF-β和IL-10分泌增加，但缺失CD80和CD86表达。TNF-α激活NF-κB信号通路或是联合AFG1激活p38通路在这一表型改变中发挥重要作用。这种表型改变的AT-II细胞可能发挥免疫抑制功能，促进CD4+T细胞向Treg细胞分化，抑制对AFG1诱发肿瘤的免疫监视功能，促进了肺腺癌发展。第三部分黄曲霉素G1和肿瘤坏死因子α协同作用对肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化应激损伤的影响目的：第一部分研究发现在AFG1诱导的肺组织慢性炎症反应中，肺泡壁上皮细胞高表达氧化应激反应标志蛋白SOD-2和HO-1，推测AFG1诱导的慢性炎症反应可能导致AT-II细胞发生氧化应激损伤。本部分进一步给予AFG1和TNF-a共同作用A549细胞，体外模拟黄曲霉素G1诱导的慢性炎症反应，探讨AFG1和TNF-a联合作用对AT-II细胞氧化应激损伤的影响。方法：1FCM方法检测AFG1处理对A549细胞中活性氧生成的影响。2采用碱性彗星实验和Western blot方法检测AFG1对A549细胞中氧化应激损伤的影响。3采用FCM和Western Blot方法观察AFG1和TNF-a联合作用对A549细胞氧化应激损伤的影响。4Real time PCR和Western Blot方法检测AFG1和TNF-a联合作用对A549细胞中Cyp450酶活性的影响。5Western Blot方法观察NF-κB信号通路在AFG1和TNF-a联合作用诱导A549细胞氧化应激损伤中可能机制。结果：1AFG1处理对A549细胞中活性氧生成的影响FCM检测结果显示，AFG1处理组中DCF和DHE的平均荧光强度高于对照组（P<0.05），且平均荧光强度的水平随着AFG1浓度的增加而增加。NAC预处理后，DCF和DHE的升高水平明显降低，与未经预处理的AFG1处理组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。提示AFG1可以提高A549细胞中ROS的水平。2AFG1对A549细胞中氧化应激损伤的影响碱性彗星实验显示，AFG1处理组细胞电泳后出现了“彗星”现象，彗星拖尾明显；NAC预处理后，“彗星”现象明显减少。Western Blot结果表明，AFG1作用A549细胞24h，γ-H2AX蛋白表达增加，该作用可被NAC预处理抑制（P<0.05）。提示AFG1可以诱导A549氧化应激损伤，导致细胞DNA双链断裂。3AFG1和TNF-a联合作用对A549细胞氧化应激损伤的影响FCM和Western Blot检测结果表明，与AFG1单独作用相比，TNF-α和AFG1联合作用可以更早引起A549细胞中ROS产生增多（P<0.05）；γ-H2AX和SOD-2的蛋白表达水平较AFG1单独处理组也明显增高（P<0.05）。AFG1单独作用对SOD-2表达没有影响。说明TNF-α与AFG1联合作用可以加速A549细胞中ROS产生，TNF-α可以促进AFG1诱导的氧化应激反应，增加DNA双链断裂损伤。4AFG1和TNF-a联合作用对A549细胞中Cyp450酶活性的影响Real-time PCR结果显示，Cyp2A13在AFG1、TNF-α单独作用，或联合作用时表达水平均明显增高，Cyp2A13在联合作用组的表达明显高于在AFG1单独处理组（P<0.05）；Cyp2A6在AFG1单独作用时表达变化不大，TNF-α与AFG1联合作用可以明显增加Cyp2A6的mRNA表达水平（P<0.05）。Western Blot方法检测了Cyp2A13的蛋白表达水平，结果与mRNA的表达情况一致。这表明TNF-α与AFG1可以协同作用上调Cyp2A13和Cyp2A6的表达，促进AFG1在A549细胞中代谢活化，可能在加剧A549细胞DNA损伤中发挥重要作用。5NF-κB信号通路在AFG1和TNF-a联合作用诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用Western Blot检测结果发现，联合处理组中NF-κB p65蛋白在细胞核中表达增高，且可被PDTC预处理有效抑制（P<0.05）。给予PDTC预处理后，联合处理组中Cyp2A13和γ-H2AX的蛋白表达明显低于未经PDTC预处理的联合作用组（P<0.05）。表明AFG1和TNF-α联合作用可能是通过激活NF-κB信号通路上调Cyp2A13表达，促进AFG1代谢活化，进而加重细胞的DAN双链断裂损伤。综上所述，我们认为在AFG1诱导的慢性炎症反应中，除了AFG1本身可以诱导AT-II细胞氧化应激损伤外，TNF-α与AFG1可以相互促进发挥协同作用，激活NF-κB信号通路，上调Cyp2A13表达，促进AFG1代谢活化，进一步提高细胞内氧化应激反应，加剧细胞的DNA损伤，进而增加细胞突变几率。结论：1灌胃AFG1可以诱导Balb/c小鼠出现肺部慢性炎症反应，表现为增加炎症细胞浸润，促进炎症细胞因子和趋化因子释放，激活NF-κB和STAT3信号通路，上调COX-2表达，出现氧化应激反应，肺泡II型上皮细胞增殖活跃，血管增生。2在AFG1诱导的肺组织慢性炎症反应中，起核心作用的炎症细胞因子TNF-α表达明显增高，可能在炎症反应中发挥重要作用。3延长灌胃AFG1诱导肺部慢性炎症模型中小鼠的存活期，小鼠肺部出现AT-Ⅱ细胞来源的不典型增生病灶和肺腺癌。肺腺癌组织中与炎症反应相关的标志物NF-κB，P-STAT3和COX-2表达增高。提示AFG1诱导肺部慢性炎症反应，提供促进肿瘤发生的微环境，可能在肺腺癌发生中起到重要作用。4在AFG1诱导的肺部慢性炎症和肺腺癌组织中，AT-Ⅱ细胞表面MHC-Ⅱ分子表达增高，Treg细胞浸润增加。提示表型改变的AT-II细胞可能发挥免疫抑制功能，诱导Treg细胞活化，参与肺腺癌的发生。5AFG1可以通过p38信号通路诱导AT-Ⅱ细胞表型成熟，上调MHC-Ⅱ和CD54表达，但共刺激因子（CD80、CD86）低表达或缺如，这可能导致AT-II细胞不能激活效应性CD4+T细胞。6AFG1与TNF-α联合作用促进AT-II细胞表型发生改变：上调HLA-DR、CD54、COX-2表达，以及免疫抑制性细胞因子TGF-β和IL-10表达。提示AFG1诱导的慢性炎症反应导致AT-II细胞表型改变，进而使其发挥免疫抑制功能，诱导幼稚CD4+T细胞向Treg细胞分化，促进肺腺癌的发生发展。7AFG1与TNF-α联合作用增加AT-Ⅱ细胞中ROS产生，加剧氧化应激反应，诱导DNA损伤。8TNF-α通过激活NF-κB信号通路，上调Cyp2A13表达，促进AFG1代谢活化，进而加剧DNA损伤。结果表明在AFG1诱导的慢性炎症微环境中，TNF-α分泌增加，AFG1与TNF-α联合作用加剧AT-II细胞的DNA损伤，可能增加细胞突变而发生癌变的几率。