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研究背景和目的:血栓性疾病脑中风和缺血性心脏病已成为威胁人类健康的两大主要杀手。血栓形成是导致脑中风和心肌梗死患者死亡的主要病理原因。尽管现在已有多种抗血栓药物,但血栓性疾病的发病率和复发率仍然很高,其根本原因是血栓形成的机制极其复杂。因此,充分认识血栓形成的机制,对于研发有效的抗血栓治疗,预防血栓性疾病的发生和降低血栓性疾病的死亡率,具有非常重要的临床意义。最近的研究表明,二硫键异构酶（protein dosulfide isomerase,PDI）家族在血小板活化和血栓形成中发挥重要的作用,其中PDI、ERp57和ERp72促进血小板活化和血栓形成,而TMX1对血小板活化和血栓形成起抑制作用。这些发现揭示PDI家族构成重要的调控血栓形成的氧化还原平衡网络。该家族有20多个成员,其它成员是否也参与血栓形成的调控是目前亟待解决的关键问题。2005年和2015年有两项研究表明,该家族成员中ERp5也参与血小板活化和血栓形成,ERp5抑制型抗体降低血小板的聚集以及小鼠体内血栓的形成。但是,2018年最新的研究表明,野生型ERp5蛋白促使Fibrinogen与其血小板受体αⅡbβ3解离,提示ERp5抑制血小板活化。上述研究结论的不一致性可能由于以下几个原因:1、上述研究所用的抗ERp5抗体抑制ERp5的作用是否具有特异性?2、ERp5抗体不能判定ERp5的生理功能;3、ERp5调控血小板活化和血栓形成是否与其CGHC活性位点有关;4、血小板自身的ERp5在调控血小板活化和血栓形成的确切作用是什么?为了解决这些突出的问题,本课题将通过构建血小板特异性ERp5敲除小鼠,确认ERp5在血小板功能和血栓形成中的生理作用,为认识ERp5调控血栓形成的作用提供确凿的遗传学资料,有助于揭示PDI家族调控血栓形成的网络机制。研究方法:1.构建血小板ERp5特异性敲除小鼠（Pf4-cre/ERp5fl/fl）,应用PCR、RT-PCR和蛋白免疫印迹法（Western blotting）鉴定ERp5的敲除情况。2.构建人野生型ERp5质粒,应用原核表达系统制备野生型ERp5蛋白（rERp5-ss-ss/rERp5-wt）。3.以野生型ERp5质粒为模板,应用基因定点突变技术构建ERp5突变型质粒,经原核表达系统制备突变型ERp5蛋白（rERp5-oo-oo/rE-Rp5-mut）。4.应用考马斯亮蓝染色（Coomassie blue staining）和蛋白免疫印迹法分析ERp5重组蛋白的纯度;应用二硫键异构酶底物Di-E-GSSG分析ERp5重组蛋白的还原酶活性。5.为了研究ERp5重组蛋白是否影响人的血小板聚集,将ERp5重组蛋白与人血小板孵育后使用凝血酶刺激,检测血小板的聚集情况。6.为了判断ERp5敲除是否影响血小板发育,应用血细胞计数仪对ERp5敲除小鼠血小板的数目进行分析。7.为了判断ERp5敲除是否影响血小板表面膜受体表达,分离对照小鼠和ERp5敲除小鼠的血小板,并结合流式细胞术（Flow cytometry）检测血小板表面主要膜受体的表达。8.为了进一步评价ERp5敲除对血小板功能的影响,分离对照小鼠和ERp5敲除小鼠血小板,应用流式细胞术检测P-selectin的表达和JON/A的结合;应用血小板聚集仪分析ERp5敲除小鼠血小板的聚集和ATP释放。9.为了探究ERp5在生理性止血中的作用,应用小鼠尾部出血时间来分析ERp5的生理作用;同时将ERp5重组蛋白通过颈静脉注射到野生型小鼠体内,进一步判断ERp5分子在止血中作用。10.为了探究ERp5是否参与动脉血栓的形成,应用FeC13诱导的肠系膜动脉血栓模型验证ERp5在体内的作用。研究结果:1.应用PCR、RT-PCR和Western blotting对构建的血小板ERp5敲除小鼠进行鉴定,结果显示ERp5在mRNA水平和蛋白水平均无表达,说明敲除小鼠小鼠构建成功。2.流式细胞术结果显示,与同窝对照小鼠相比,血小板ERp5敲除小鼠血小板表面主要膜受体表达没有差异。3.血细胞数目结果显示,与同窝对照小鼠相比,血小板ERp5敲除小鼠的血小板数目减少。4.野生型ERp5蛋白和突变型ERp5蛋白均抑制人血小板聚集。5.使用凝血酶刺激,与对照小鼠血小板相比,ERp5敲除小鼠血小板聚集、ATP释放、P-selectin表达、JON/A结合等功能均明显增强;当加入野生型ERp5蛋白后,ERp5敲除小鼠血小板聚集的增加逆转,说明ERp5负性调控血小板功能和整合素αⅡbβ3活化。6.小鼠尾部出血时间模型显示,与对照小鼠相比,ERp5敲除小鼠尾部出血时间缩短,表明ERp5抑制生理性止血;且注射野生型ERp5蛋白和突变型ERp5蛋白的野生型小鼠,与对照小鼠相比,尾部出血时间均延长,进一步表明ERp5抑制生理性止血。7.FeCl3诱导的肠系膜动脉血栓模型结果显示,与对照小鼠相比,ERp5敲除小鼠肠系膜动脉损伤部位血小板积聚明显增加,说明ERp5抑制动脉血栓形成。结论:二硫键异构酶ERp5负性调控血小板活化和血栓的形成。