利用酵母双杂交筛选与IFT20发生相互作用的蛋白研究

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目的:  鉴定IFT20蛋白在雄性小鼠中的表达情况;运用酵母双杂交试验筛选出可能与IFT20蛋白有相互作用的蛋白,为IFT20参与精子发生的机制研究提供理论依据。  方法:  分别提取昆明种成年雄性小鼠脑、肺、肾、肝、脾、睾丸及小鼠不同发育时期睾丸组织的总蛋白,Western Blot检测IFT20表达,睾丸组织切片及生精细胞分离,免疫荧光染色观察IFT20蛋白的定位;运用PubMed数据库,根据小鼠Ift加的编码序列(CDS区)设计特异性引物;RT-PCR扩增小鼠睾丸总RNA,Ifi20 cDNA经TA克隆后与pGBKT7载体构建Ift20/pGBKT7重组质粒,酶切和测序鉴定筛选出正确的目的质粒;将Ifi20/pGBKT7重组质粒转入制备好的AH109感受态细胞中,与Clontech公司提供的已提前转入Y187感受态细胞中预转化的小鼠文库重组质粒进行酵母双杂交筛选试验,挑取800个样品初步筛选,经酵母质粒小提后测序,分析重复检出次数在8次以上的蛋白,并挑选关键性蛋白进行进一步分析。  结果:  Western Blot结果表明IFT20在肺、肾、肝、脾、睾丸组织中均有表达,但在睾丸组织中的表达最丰富,且在睾丸中IFT20的表达随着精子发生过程逐渐增加,在精子发生的第三阶段(出生后第30天及之后)表达丰富,免疫荧光染色显示IFT20在睾丸组织表达量丰富,在生精细胞中,IFT20蛋白在精子发生的第三阶段定位于精子领部位;酶切和测序鉴定Ift20/pGBKT7重组质粒构建成功。酵母双杂交筛选试验测序结果显示共248个蛋白被筛选出可能与IFT20相互作用,其中SPATA1出现次数46次为最多,其次是IFT81、WAC、HAUS1、TEX12、SNAPIN等。选择性研究IFT20与SNAPIN的相互作用,结果显示与IFT20一样,SNAPIN也在雄性小鼠出生后第30天表达量开始明显增加,在精子发生第三阶段也定位于精子领部位;酵母双杂交转化、体外细胞转染和免疫共沉淀试验证实SNAPIN与IFT20之间存在直接相互作用,IFT20可募集SNAPIN从胞浆抵达到囊泡表达,IFT20与SNAPIN存在于同一蛋白复合物中。  结论:  酵母双杂交试验初步筛选出SPATA1、IFT81、WAC、HAUS1、TEX12、SNAPIN很大可能与IFT20相互作用,进一步分析证实了IFT20与SNAPIN存在于同一复合物中。
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