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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一种高度变异及传染的单股正链RNA病毒，目前还没有得到有效的控制，给世界养猪业带来极大的损失。mRNA处理小体（processing bodies，P-Body）是细胞质内参与基因转录后调控的mRNA-蛋白质复合体，是不具有包膜的亚细胞结构。主要参与细胞的翻译抑制、RNA介导的基因沉默、mRNA降解等重要生命活动。P-body的装配能够影响病毒在细胞内的复制，同时病毒的复制又反过来影响P-body的装配。LSm1及DCP2定位于P-body中，是P-body的标志性蛋白，能够影响许多病毒的复制。为了探索PRRSV复制过程中与宿主P-body的相互作用关系，本研究运用分子生物学、基因工程、细胞生物学等实验技术，获取 PRRSV核衣壳蛋白 N、P-Body标志蛋白 DCP2、LSm1基因序列，对其核苷酸序列与编码的氨基酸序列进行分析，构建携带N、DCP2、LSm1基因的原核表达质粒，诱导表达后纯化，免疫兔子制备高免血清。并从基因转录水平初步探索PRRSV复制过程中对宿主DCP2、LSm1的影响。 1.PRRSV N基因的扩增及其编码蛋白高免血清的制备。PCR扩增出N基因编码区全长后，将其连接到pColdI原核表达质粒上，得到重组质粒pColdI-N。序列测定显示N基因核苷酸序列长度为372 bp。序列分析结果显示，PRRSV分离株E11105与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a核苷酸序列同源性分别为93.3％、34.7％、99.2％、95.4％，氨基酸序列同源性分别为94.4％、15.3％、94.4％、99.2％，表明E11105毒株属于美洲型PRRSV，与中国高致病性PRRSV亲缘关系较近；预测N蛋白不具有信号肽，为非分泌蛋白，存在5个B细胞优势抗原表位。诱导表达重组N蛋白分子量约为16.7 kD，主要以不可溶性蛋白形式存在，但也存在可溶性蛋白。重组N蛋白纯化后免疫兔子，成功获得了针对N蛋白的高免血清。且针对可溶性N蛋白的兔源高免血清效价较高，为1：12800，而针不可溶性重组N蛋白的兔源高免血清效价仅为1：3200。试验结果为研究PRRSV N蛋白的功能特性及PRRSV致病机理奠定了基础。 2.P-Body组件蛋白DCP2基因的扩增及高免血清的制备。利用PCR技术扩增出DCP2之后，将其连接到克隆质粒上进行测序，结果显示获得了 DCP2基因两种转录变异体编码区全长，分别为转录变异体X1、X2，长度为1263 bp和1158 bp，DCP2转录变异体X1编码的氨基酸序列比X2编码的氨基酸序列在从第314个氨基酸至第349个氨基酸的位置多出36个氨基酸，其他地方完全一致。选取较长的转录变异体X1进行生物信息学分析，结果表明，DCP2转录变异体 X1基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列在不同哺乳动物中的相似性较高，在94%以上，具有较高的保守性。预测Marc145细胞源DCP2转录变异体X1蛋白不具有跨膜结构和信号肽，是非分泌蛋白，具有良好的优势抗原表位。将 DCP2转录变异体 X1基因连接到pColdI原核表达载体上，诱导表达的原核重组蛋白为不可溶性蛋白，纯化后免疫兔子，成功获得了针对DCP2转录变异体X1蛋白的兔源高免血清，效价为1：6400，试验结果为进一步研究DCP2的功能及其在病毒复制中作用的机制奠定了坚实基础。 3.P-Body组件蛋白LSm1基因的扩增及原核表达质粒的构建。经过巢式PCR两轮的扩增后，成功得到了Marc145细胞源LSm1基因编码区全长，将其连接到pColdI原核表达载体上，测序结果显示其长度为402 bp，编码133个氨基酸。其核苷酸序列与人类、灵长类相似性较高，其次是海洋哺乳动物类，最后是陆地野生动物及家畜，相似性为92.8%-99.8%，而其编码的氨基酸虽没有此规律，但氨基酸序列相似性都较高，相似性为97.8%-99.3%。预测此 LSm1蛋白无跨膜区域，无信号肽区域，为非分泌蛋白，存在4个B细胞优势抗原表位。携带LSm1基因的重组原核表达质粒诱导结果显示，没有表达重组LSm1蛋白。研究结果表明LSm1蛋白在细胞内转录及表达水平可能较低，细胞cDNA须通过巢式PCR扩增两轮才能出现目的条带，LSm1重组表达蛋白不在本研究的表达系统中表达，需考虑通过更换表达系统、截短表达、融合表达等方法获得高浓度的LSm1重组原核表达蛋白。本试验为LSm1基因的扩增提供了参考，为获得LSm1人工表达蛋白与针对LSm1蛋白的特异性抗体，以及在细胞水平研究LSm1的功能机制及其在病毒复制中的作用奠定坚实基础。 4.PRRSV复制对宿主LSm1、DCP2基因转录水平的影响。PRRSV接种Marc145细胞之后，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h收集细胞提取总RNA反转录，利用qPCR方法检测PRRSV N基因、Marc145宿主细胞LSm1、DCP2基因转录水平。结果显示，随着PRRSV在Marc145细胞内的复制，宿主细胞LSm1转录水平各个时段明显增加，而DCP2转录水平0-8 h明显下降，8-48 h明显升高。这表明PRRSV的复制对宿主细胞P-Body标志性蛋白LSm1及 DCP2的转录水平具有一定的影响。试验结果为后续进一步研究 PRRSV复制与LSm1及DCP2的作用关系奠定了坚实基础。