蝎是一种在世界上分布极为广泛的毒液动物,四亿多年的适应与进化使其产生了毒腺与毒腺中多种多样的生物活性组分。这些以蛋白和多肽为主的生物活性组分对于蝎种自身的捕食与防御具有不可替代的作用,也给现代生物医药研发提供了十分宝贵的分子资源。然而,虽然蝎作为药物使用的历史已超过两千多年,但目前对于蝎毒素的研究仍然聚焦于少数几个蝎种和它们丰度较高的几种毒素类型上,由于不同蝎种间毒素存在丰富的多样性,大量具有重要生物学意义的毒素组分仍亟待发掘。另外,通过毒素分离与组学分析的方法,蝎种之间毒素的差异已被广泛接受,但对于同一蝎种中毒素差异的比较研究很少,蝎毒素的种内多样性需要更为全面清晰地阐明。本文通过构建蝎毒腺组织cDNA文库的方法,对不同地域来源的细尖狼蝎进行了毒素转录组学比较分析,获得了大量新的毒素分子,阐明了蝎毒素存在显著的种内多样性,同时也克隆、表达、鉴定了首个蝎毒液来源的Kunitz型毒液蛋白SdPI （Scorpion derived Protease Inhibitor）。本室从海南省和云南省采集获得了2种蝎样本,根据形态学特征鉴定它们属于同一蝎种——细尖狼蝎（Lychas mucronatus）的不同地域种。通过构建海南细尖狼蝎（Hainan-sourced Lychas mucronatus）与云南细尖狼蝎（Yunnan-sourced Lychas mucronatus）的毒腺组织cDNA文库,并进行转录组学分析,共分离和鉴定了158个新的蝎毒素基因。这些毒素基因依据同源性可分为20个类型,包括钠毒素、α-钾毒素、β-钾毒素、脂类分解激活肽、钙毒素、小阳离子抗菌肽、ponericin类似肽、BmKbpp类似肽、酸性肽、甘氨酸富集肽、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、8C-toxin、唾液蛋白、La1类似肽、金属蛋白酶、TIL类似肽（Trypsin inhibitor like peptide）、细胞毒性肽、氯毒素以及非典型毒素（Atypical toxin）。其中甘氨酸富集肽、8C-toxin和唾液蛋白是三种新型蝎毒素。该研究结果展示了蝎毒素分子的极端多样性。然后,通过对海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库的比较转录组学分析发现,海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎毒液中拥有16种共同的已知毒素类型：它们分别是钠毒素、α-钾毒素、p-钾毒素、脂类分解激活肽、钙毒素、小阳离子抗菌肽、ponericin类似肽、BmKbpp类似肽、酸性肽、甘氨酸富集肽、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A2、8C-toxin、唾液蛋白、Lal类似肽、金属蛋白酶和TIL类似肽,且它们在毒液中的丰度都相对较高。进一步分析发现在细尖狼蝎两个地域种的毒液中相同毒素类型的丰度明显不同,且毒素序列也存在显著差异：海南细尖狼蝎毒液中含有丰度较高且序列更为多变的钠毒素和抗菌肽,而云南细尖狼蝎毒液中的钾毒素则更为丰富多变。这些研究结果系统证实了细尖狼蝎毒液蛋白组分存在十分明显的种内多样性,同时也表明了蝎种在不同选择压力下可能通过毒液中现有毒素类型的丰度与氨基酸序列的变化来适应新的生存环境。最后,通过大规模EST分析与序列同源性搜索,从云南细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库中筛选到了一个全新的Kunitz型毒液蛋白基因SdPI。SdPI全长cDNA为364 nt,其中243 nt的开放阅读框总共编码80个氨基酸：21个氨基酸残基的信号肽以及59个氨基酸残基的成熟肽。SdPI具有与其它动物毒液来源的Kunitz型毒液蛋白相似的氨基酸序列,但序列中半胱氨酸的结构模体却发生了改变。根据SdPI的cDNA序列设计引物,PCR扩增其成熟肽编码序列,构建重组表达载体pET28a-SdPI,转化受体菌E.coli Rosetta后,IPTG诱导表达。运用包涵体变性复性结合RP-HPLC的方法获得了色谱纯的重组SdPI蛋白。高纯度重组SdPI蛋白的得率达到5.5 mg/L培养液。丝氨酸蛋白酶抑制实验表明,重组SdPI蛋白能显著地抑制胰蛋白酶活性,其Ki为1.6×10-7 M,且具有很强的热稳定性。定点突变实验结合CD和酶抑制试验进一步证明了SdPI的活性中心为第14位的赖氨酸残基,与天然Kunitz结构模体的活性中心相似。综上所述,对属于同一蝎种的海南细尖狼蝎与云南细尖狼蝎进行了详尽的转录组学比较分析,发现了158个新的蝎毒素基因,分属于20个毒素类型,不仅为创新药物研发提供了大量的候选分子,也首次全面地阐述了蝎毒素的种内多样性,为了解蝎毒素的适应性进化提供了线索。同时鉴定了首个蝎毒液来源的Kunitz型毒液蛋白SdPI的功能,为了解蝎毒液中的未知毒素类型进行了探索,也为开发蝎毒液来源的蛋白酶抑制剂类多肽药物奠定了基础。