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过氧化还原酶6（Peroxiredoxin6,Prdx6）是一种具有非硒谷胱甘肽过氧化物酶（no-Se gluta-thione peroxidase,NSGPx）和酸性非钙依赖的磷脂酶A2活性（acid calcium-independent phospholipidase A2,aiPLA2）的双功能蛋白。前期本课题组人员发现，与假手术组相比，大鼠大脑中动脉阻塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）中Prdx6显著上调。免疫荧光（Immunofluorescence,IF）共标的方法发现，MCAO大鼠的脑组织中上调的Prdx6蛋白主要表达在星形胶质细胞中，而在小胶质细胞和神经元中不表达。随后，为了进一步研究Prdx6在脑缺血再灌注损伤中对大鼠大脑中神经细胞的作用，本课题组成功构建了Prdx6敲除大鼠。行为学检测显示Prdx6敲除后，与野生型（Wild type,WT）大鼠相比，水迷宫实验中大鼠的游泳总距离、穿越平台次数、平均速度、穿越象限次数水中和停留时间均无统计学差异。旷场实验中，Prdx6敲除组大鼠的移动总距离、平均速度、穿格次数、站立次数和捋毛次数较WT组明显降低。而粪便量两组间无显著性差异。免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测发现Prdx6敲除后神经元标记物神经核蛋白（Neural nuclei protein,NeuN）染色深浅程度明显比WT组浅（P<0.01）；用离子钙接头蛋白-1（Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,IBA-1）标记小胶质细胞，发现Prdx6敲除后内嗅皮层IBA-1阳性细胞数量明显较WT组增多(P<0.01)；Prdx6敲除对星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）染色深浅程度没有影响，但Prdx6敲除组海马区域星形胶质细胞突起长度明显缩短（P<0.01）。同时对Prdx6敲除大鼠进行MCAO造模，2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法（2,3,5-Triphenyte-trazoliumchloride,TTC）发现，与WT组相比，Prdx6敲除组缺血灶面积明显减小（P<0.01）。IHC染色发现，在MCAO模型中，Prdx6敲除组神经元染色深浅程度明显比WT组深，且小胶质细胞激活减少。用增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）标记大鼠脑内增殖细胞神经细胞，发现Prdx6敲除模型组的增殖细胞数量较WT模型组增多。本研究发现：与WT组相比，Prdx6敲除组神经元染色变浅，小胶质细胞数量增多，星形胶质细胞突起缩短；MCAO模型后，Prdx6敲除组缺血中心区和缺血边缘区的神经元标记物染色加深，小胶质细胞激活减少，缺血灶面积减少，增殖细胞增多。该结果不仅阐述了Prdx6在脑缺血再灌注损伤中对大鼠脑神经细胞的影响，也为脑卒中的靶向治疗奠定基础。
目的：
1.检测大鼠MCAO模型中Prdx6表达情况及神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞标志物的变化；
2.比较WT大鼠和Prdx6敲除大鼠记忆力和探索能力的差别，以及Prdx6敲除对神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的影响；
3.观察在Prdx6敲除对大鼠大脑缺血再灌注的影响，包括Prdx6对神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和缺血灶面积的影响；
方法：
用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）鉴定Prdx6敲除大鼠是否构建成功。水迷宫实验和旷场实验检测大鼠记忆力和探索能力。运用大鼠中动脉阻塞模型构建脑缺血再灌注损伤模型。苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色法和TTC染色法证明MCAO模型是否成功；免疫荧光法（IF）检测星形胶质细胞的突起变化；蛋白印迹（WB）检测MCAO造模之后Prdx6、NeuN、GFAP、IBA-1蛋白表达情况；免疫组织化学法（IHC）检测组织切片中NeuN、GFAP、IBA-1的表达情况；TTC染色法检测野生型MCAO组和Prdx6敲除MCAO组中缺血灶面积的改变。
结果：
1.MCAO模型增加Prdx6蛋白表达，并且小胶质细胞和星形胶质细胞明显激活，神经元大量丢失
用HE染色法和TTC染色法验证造模是否成功。HE染色中发现缺血区域组织坏死液化，胞质颜色深浅不均。TTC染色显示，脑片中出现白色部分为缺血坏死部分，未缺血部分为红色，说明造模成功。分离假手术组和MCAO组缺血侧皮质，用WB方法检测皮质中的Prdx6、GFAP、IBA-1和NeuN蛋白的表达情况，与假手术组相比，MCAO造模组Prdx6、GFAP和IBA-1的明显升高，NeuN的表达明显减少，均具有统计学意义。
2.Prdx6敲除对大鼠记忆力无明显影响，但会明显减弱大鼠对外界的探索能力
为了探究Prdx6敲除对大鼠记忆力和空间探索能力的影响，进行了水迷宫实验和旷场实验。水迷宫结果显示，Prdx6敲除对大鼠记忆力没有影响，数据结果显示无统计学差异。之后进行为期一天的旷场实验，与野生型对照组相比，Prdx6敲除大鼠总路线长度、平均速度、穿格次数和捋毛次数均有下降趋势，且有统计学差异。粪便量两组间无明显差异。
3.Prdx6敲除缩小MCAO模型中缺血灶面积
取野生型和Prdx6敲除大鼠进行MCAO造模，缺血2h，再灌注24h后取脑，用PBS冲洗后，放入-20℃冰箱冻2h，切成相同厚度的2mm薄片，用TTC进行染色。结果显示，Prdx6敲除MCAO模型大鼠第三和第四片脑片区域缺血灶面积较野生型MCAO组明显缩小，且具有统计学差异（P<0.01）。
4.Prdx6敲除减弱神经元NeuN染色，增加小胶质细胞数量，而对星形胶质细胞GFAP染色没有影响，但会使星形胶质细胞突起变短
主要分析大鼠脑的皮质中的内嗅皮层和海马的CA1、CA2和CA3区域。用IHC检测神经细胞的变化。发现与野生型大鼠相比，Prdx6敲除大鼠的皮质和海马NenN染色明显变浅，具有统计学差异（P<0.01）；海马区域小胶质细胞数量减少，但没有统计学差异，可能是因为小胶质细胞在海马区域表达较少。但在皮质内嗅皮层区域，小胶质细胞明显减少，具有统计学差异（P<0.01）；接着用GFAP标记星型胶质细胞，发现与野生型对照组相比，Prdx6敲除对大鼠皮质和海马中的星形胶质细胞染色均没有影响，无统计学差异。之后进行了免疫荧光单标实验，用GFAP标记星形胶质细胞，在激光共聚焦显微镜下观察星形胶质细胞突起长度的变化。结果显示，与野生型相比，Prdx6敲除之后星形胶质细胞突起变短。
5.Prdx6敲除增加MCAO模型大鼠神经元染色，减少小胶质细胞激活
同样用IHC检测野生型MCAO模型组和Prdx6敲除MCAO模型组中神经元和小胶质细胞的数量变化。用NeuN标记神经元，Prdx6敲除组缺血中心区和缺血边缘区的神经元染色明显较野生型组深，且均具有统计学差异。接着用IBA-1标记小胶质细胞，发现与野生型对照组相比，Prdx6敲除大鼠缺血边缘区的小胶质细胞激活明显减少，且具有统计学差异（P<0.05），但在缺血中心区无统计学差异，可能是因为缺血区域脑细胞损伤严重，几乎无完整脑细胞形态。
结论：
1.在MCAO模型大鼠的大脑皮层中，Prdx6蛋白表达明显上调，小胶质细胞标记物IBA-1和星形胶质细胞标记物GFAP明显减少，神经元标记物NeuN大量丢失；
2.Prdx6敲除对大鼠记忆力无明显影响，但能降低大鼠空间探索能力；
3.Prdx6敲除减少神经元标记物NeuN表达，增加小胶质细胞数目，使星形胶质细胞突起变短；
4.在MCAO模型中，Prdx6敲除增加神经元标记物NeuN表达，减少小胶质细胞激活，减少缺血灶面积.
目的：
1.检测大鼠MCAO模型中Prdx6表达情况及神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞标志物的变化；
2.比较WT大鼠和Prdx6敲除大鼠记忆力和探索能力的差别，以及Prdx6敲除对神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的影响；
3.观察在Prdx6敲除对大鼠大脑缺血再灌注的影响，包括Prdx6对神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和缺血灶面积的影响；
方法：
用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）鉴定Prdx6敲除大鼠是否构建成功。水迷宫实验和旷场实验检测大鼠记忆力和探索能力。运用大鼠中动脉阻塞模型构建脑缺血再灌注损伤模型。苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色法和TTC染色法证明MCAO模型是否成功；免疫荧光法（IF）检测星形胶质细胞的突起变化；蛋白印迹（WB）检测MCAO造模之后Prdx6、NeuN、GFAP、IBA-1蛋白表达情况；免疫组织化学法（IHC）检测组织切片中NeuN、GFAP、IBA-1的表达情况；TTC染色法检测野生型MCAO组和Prdx6敲除MCAO组中缺血灶面积的改变。
结果：
1.MCAO模型增加Prdx6蛋白表达，并且小胶质细胞和星形胶质细胞明显激活，神经元大量丢失
用HE染色法和TTC染色法验证造模是否成功。HE染色中发现缺血区域组织坏死液化，胞质颜色深浅不均。TTC染色显示，脑片中出现白色部分为缺血坏死部分，未缺血部分为红色，说明造模成功。分离假手术组和MCAO组缺血侧皮质，用WB方法检测皮质中的Prdx6、GFAP、IBA-1和NeuN蛋白的表达情况，与假手术组相比，MCAO造模组Prdx6、GFAP和IBA-1的明显升高，NeuN的表达明显减少，均具有统计学意义。
2.Prdx6敲除对大鼠记忆力无明显影响，但会明显减弱大鼠对外界的探索能力
为了探究Prdx6敲除对大鼠记忆力和空间探索能力的影响，进行了水迷宫实验和旷场实验。水迷宫结果显示，Prdx6敲除对大鼠记忆力没有影响，数据结果显示无统计学差异。之后进行为期一天的旷场实验，与野生型对照组相比，Prdx6敲除大鼠总路线长度、平均速度、穿格次数和捋毛次数均有下降趋势，且有统计学差异。粪便量两组间无明显差异。
3.Prdx6敲除缩小MCAO模型中缺血灶面积
取野生型和Prdx6敲除大鼠进行MCAO造模，缺血2h，再灌注24h后取脑，用PBS冲洗后，放入-20℃冰箱冻2h，切成相同厚度的2mm薄片，用TTC进行染色。结果显示，Prdx6敲除MCAO模型大鼠第三和第四片脑片区域缺血灶面积较野生型MCAO组明显缩小，且具有统计学差异（P<0.01）。
4.Prdx6敲除减弱神经元NeuN染色，增加小胶质细胞数量，而对星形胶质细胞GFAP染色没有影响，但会使星形胶质细胞突起变短
主要分析大鼠脑的皮质中的内嗅皮层和海马的CA1、CA2和CA3区域。用IHC检测神经细胞的变化。发现与野生型大鼠相比，Prdx6敲除大鼠的皮质和海马NenN染色明显变浅，具有统计学差异（P<0.01）；海马区域小胶质细胞数量减少，但没有统计学差异，可能是因为小胶质细胞在海马区域表达较少。但在皮质内嗅皮层区域，小胶质细胞明显减少，具有统计学差异（P<0.01）；接着用GFAP标记星型胶质细胞，发现与野生型对照组相比，Prdx6敲除对大鼠皮质和海马中的星形胶质细胞染色均没有影响，无统计学差异。之后进行了免疫荧光单标实验，用GFAP标记星形胶质细胞，在激光共聚焦显微镜下观察星形胶质细胞突起长度的变化。结果显示，与野生型相比，Prdx6敲除之后星形胶质细胞突起变短。
5.Prdx6敲除增加MCAO模型大鼠神经元染色，减少小胶质细胞激活
同样用IHC检测野生型MCAO模型组和Prdx6敲除MCAO模型组中神经元和小胶质细胞的数量变化。用NeuN标记神经元，Prdx6敲除组缺血中心区和缺血边缘区的神经元染色明显较野生型组深，且均具有统计学差异。接着用IBA-1标记小胶质细胞，发现与野生型对照组相比，Prdx6敲除大鼠缺血边缘区的小胶质细胞激活明显减少，且具有统计学差异（P<0.05），但在缺血中心区无统计学差异，可能是因为缺血区域脑细胞损伤严重，几乎无完整脑细胞形态。
结论：
1.在MCAO模型大鼠的大脑皮层中，Prdx6蛋白表达明显上调，小胶质细胞标记物IBA-1和星形胶质细胞标记物GFAP明显减少，神经元标记物NeuN大量丢失；
2.Prdx6敲除对大鼠记忆力无明显影响，但能降低大鼠空间探索能力；
3.Prdx6敲除减少神经元标记物NeuN表达，增加小胶质细胞数目，使星形胶质细胞突起变短；
4.在MCAO模型中，Prdx6敲除增加神经元标记物NeuN表达，减少小胶质细胞激活，减少缺血灶面积.