α-葡萄糖苷酶位于小肠绒毛上皮细胞,可特异性地切断α-1,4糖苷键释放葡萄糖,提高机体餐后血糖水平。因此,通过抑制α-葡萄糖苷酶活性来降低餐后高血糖水平是治疗II型糖尿病的有效途径,α-葡萄糖苷酶抑制剂在降低血糖浓度、降低糖基化血红蛋白水平、降低糖尿病并发症的发病率等方面起着至关重要的作用。临床常用降糖药物阿卡波糖和伏格列波糖等通常会给患者带来肝损伤、腹绞痛或胃肠道问题,且制备工艺繁琐成本高。近年来,越来越多的研究人员青睐于从天然产物中筛选具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物,期望获得临床安全且有效的新型药物。研究表明,中药淫羊藿具有显著降糖作用,含淫羊藿的成方制剂如消渴方和通脉降糖胶囊已被临床用于缓解糖尿病综合症,但其发挥作用的具体活性成分及作用机理尚未明确。因此,本论文研究利用共价结合构建了固定化α-葡萄糖苷酶,并通过“配体垂钓”从淫羊藿提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂,并对其结构及体外降糖机理进行了研究;在此基础上,还构建了双相酶水解体系和基于固定化酶的新型连续酶水解体系以制备淫羊藿中的降糖活性成分宝藿苷I。研究内容可分为以下四个部分:1.建立了淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷II和宝藿苷I等八种黄酮苷的UPLC-UV分析方法,并进行了方法学考察。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH-C18（150 mm L.×2.1 mm I.D.,1.7μm）;检测波长为270 nm;流速为0.2 m L/min;进样量为1μL;柱温为35°C;采用梯度洗脱,流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液。在该色谱条件下,8种黄酮苷实现基线分离（R>1.5）,且淫羊藿提取物中所含杂质及酶水解过程产生的其他物质均不干扰淫羊藿黄酮苷的测定;八种淫羊藿黄酮苷在0.7812μg/m L～200.0μg/m L浓度范围内,峰面积与浓度线性关系良好（r~2?0.9999）;精密度、重复性和稳定性试验的RSD均小于2%;平均回收率在97%～103%之间,RSD均小于2%。上述结果表明所建立的UPLC-UV法能准确、可靠地同时测定八种淫羊藿黄酮苷的含量,为鉴别淫羊藿提取物中降血糖活性成分以及酶水解产物的鉴定与纯度测定提供可靠的检测方法。2.制备了磁性纳米粒固定化α-葡萄糖苷酶,通过该固定化酶从淫羊藿提取物中“垂钓”潜在α-葡萄糖苷酶抑制剂,并对筛选所得化合物进行结构鉴定及其抑酶作用的机理研究。首先,采用单因素试验及响应面Box-Behnken设计优化了制备磁性纳米粒固定化α-葡萄糖苷酶的条件,即缓冲液p H值6.8,α-葡萄糖苷酶浓度为1.2 mg/m L,固定化时间为4.2 hrs;然后,建立了基于固定化酶筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的模型,从淫羊藿提取物中筛选得到8个具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物,经UPLC-ESI-QQQ-MS分析分别鉴定为宝藿苷I、箭藿苷B、箭藿苷A、鼠李糖基淫羊藿次苷II、淫羊藿苷、朝藿定C、朝藿定A和朝藿定B。体外酶活性抑制试验和分子对接模拟结果表明,与阳性对照药物阿卡波糖相比,宝藿苷I和箭藿苷B对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用更强,并且明显高于其他6个化合物;此外,这8个化合物均是通过疏水作用和氢键作用与α-葡萄糖苷酶的活性中心位点结合并发挥抑制作用,其中宝藿苷I的结合自由能最低,显示出较强的酶抑制活性。3.建立并优化了双相酶水解体系以制备宝藿苷I,并进行工程化研究及收益估算。在常规酶水解的基础上,以乙酸丙酯/缓冲液体积比为2?1构建双相酶水解体系,并对双相酶水解条件进行优化;结果表明,淫羊藿苷于60°C下水解6.0hrs并静置1.0 hr后,淫羊藿苷的转化率与宝藿苷I的转移率分别为99.8%和80%;该体系水解底物淫羊藿苷的能力从0.5 mg/m L大幅度提高到100 mg/m L。当淫羊藿苷的加入量减半,含β-葡聚糖酶缓冲液重复使用3次时,淫羊藿苷的转化率仍可达到89.5%。双相酶水解体系经50倍和100倍放大,淫羊藿苷的转化率分别为99.9%和98.5%,宝藿苷I的得率为69%,其纯度?98.0%。此外,进行了年产一吨宝藿苷I的工艺流程和车间设计,并根据实际情况和设计图纸进行成本核算和收益估算。4.拟构建基于固定化β-葡聚糖酶的填充床反应器,将酶连续应用于高效、绿色地制备宝藿苷I。以戊二醛为交联剂,将β-葡聚糖酶固定于壳聚糖凝胶球;单因素考察结果表明,当戊二醛浓度为1.0%,交联时间为2.0 hrs,β-葡聚糖酶液浓度为1.5 mg/m L、固定化时间为10.0 hrs时,酶的固定化率、固定化酶的酶活回收率以及淫羊藿苷的相对转化率达到最高水平。在构建固定化酶填充柱连续制备宝藿苷I的过程中,发现了影响水解效果的关键因素,包括底物与产物的理化性质、水解酶的纯度与性质、固定化酶的稳定性和载样方式等,为后续固定化酶填充床生物反应器连续制备活性次级苷的研究提供了参考与思路。