【摘 要】
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精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是精子源源不断产生的基础,其特殊的干性在雄性不育治疗及物种保存等领域都具有广阔的应用前景。在啮齿动物中,SSCs的体外培养及特异性的分子标记已被广泛的研究报道,但在大型家畜如牛、猪中因取材不便、生长周期长等原因进展十分缓慢,并且由于种属间的巨大差异,特异性标记蛋白在牛SSCs中需进一步验证,并积极探寻新的分子标记。基于上述问
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精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是精子源源不断产生的基础,其特殊的干性在雄性不育治疗及物种保存等领域都具有广阔的应用前景。在啮齿动物中,SSCs的体外培养及特异性的分子标记已被广泛的研究报道,但在大型家畜如牛、猪中因取材不便、生长周期长等原因进展十分缓慢,并且由于种属间的巨大差异,特异性标记蛋白在牛SSCs中需进一步验证,并积极探寻新的分子标记。基于上述问题,我们建立了牛SSCs无饲养层培养体系。分离纯化犊牛睾丸SSCs,体外培养至第7 d时,SSCs开始增殖并出现圆形细胞克隆,第20 d时,SSCs克隆呈放射状;碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AKP）染色表明细胞克隆呈AKP强阳性;细胞免疫荧光染色表达多能性蛋白SRY-box转录因子2（SRY-box transcription factor 2,SOX2）和SSCs特异性标记泛素C端水解酶（Ubiquitin C-terminal hydrolase 1,UCHL1）;q RT-PCR表达多能性基因八聚体结合转录因子4（Octamer binding transcription factor 4,OCT4）及SSCs特异性标记基因早幼粒细胞白血病锌脂（Promyelocytic leukaemia zinc finger,PLZF）;以上结果表明在无饲养层体系中培养的细胞克隆为牛SSCs。研究表明,胶质细胞源神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）家族受体α1（GDNF family receptor alpha-1,GFRα1）和磷脂酶D家族成员6（Phospholipase D family member 6,PLD6）可作为小鼠SSCs标记蛋白,但在牛睾丸中的表达尚不清楚,因此本研究对GFRα1和PLD6能否作为牛SSCs的特异性标记进行了验证。犊牛睾丸组织苏木精-伊红（HE）染色显示生精母细胞/SSCs位于曲细精索中心部,免疫组化及曲细精索免疫荧光漂浮染色表明GFRα1+细胞与HE染色中SSCs位置一致;免疫荧光染色表明GFRα1+细胞为NANOG+（多能性蛋白）细胞;m RNA水平上进一步验证了犊牛曲细精索表达NANOG及GFRA1;以上结果表明GFRα1可作为牛SSCs的特异性标记蛋白。在PLD6验证实验中,免疫组化显示PLD6在犊牛睾丸组织中定位于SSCs,在成年牛睾丸组织中还表达于精原细胞;免疫荧光双标染色表明PLD6+细胞与生殖细胞标记蛋白死盒解旋酶4（DEAD-box helicase 4,DDX4,又称VASA）阳性细胞完全重合,与UCHL1+细胞部分重合;免疫荧光染色表明SSCs克隆呈PLD6+;q RT-PCR结果显示PLD6在成年牛睾丸组织中的表达量显著高于犊牛,且在SSCs中的表达量显著高于支持细胞;以上结果表明PLD6表达于SSCs中,可用来标记性成熟前牛SSCs,而在成年牛中不具有SSCs特异性。研究表明组蛋白H3赖氨酸（K9）的三甲基（Histone 3 trimethylated on lysine9,H3K9me3）修饰与小鼠SSCs的发育关系密切,因此本研究最后探究了H3K9me3与牛SSCs增殖的关系。通过甲基转移酶的抑制剂Chaetocin处理SSCs及向SSCs中转染甲基转移酶色斑3-9抑制因子同源物1（Suppressor of variegation3-9 homolog 1,SUV39H1）的si RNA降低H3K9me3的水平,EDU细胞增殖标记实验检测到细胞增殖被抑制;而SSCs中转染去甲基化酶赖氨酸脱甲基酶4D（lysine demethylase 4D,KDM4D）的si RNA,则上调了SSCs中H3K9me3的水平,EDU细胞增殖实验显示促进了细胞的增殖。综上所述,本研究建立无饲养层培养体系获得了牛SSCs,并对GFRα1及PLD6能否作为牛SSCs的标记蛋白进行了验证,最后通过调控H3K9me3水平探究了其对牛SSCs增殖的影响,为阐明组蛋白甲基化修饰在牛SSCs增殖分化中的调控机制奠定了基础。
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