目的:构建同时携有bcl-2与stathmin基因小发卡RNA(shRNA)干扰的慢病毒表达载体,为进一步观察沉默stathrnin与bcl-2基因逆转紫杉醇耐药的可行性做前期的准备工作。　　 方法:　　 1.shRNA表达框片段的获得。设计引物引入XbaⅠ、XhoⅠ酶切位点,分别以前期实验构建的表达质粒pGPH1/GFP/Neo-stathmin、pGPU6/GFP/Neo-bel-2、pGPU6/GFP/Neo-NC(NC为非特异性序列)为模板,通过PCR扩增出由H1启动子调控的shRNA表达框片段(H1-stathmin)、U6启动子调控的shRNA表达框片段(U6-bcl-2)及(U6-NC)。2.应用XbaⅠ、XhoⅠ双酶切PCR产物shRNA表达框片段(H1-stathmin、U6-bcl-2、U6-NC)和慢病毒转移质粒PLB,将酶切纯化后的shRNA表达框片段与线性化的慢病毒干扰质粒PLB分别连接,获得重组载体PLB-bcl-2/shRNA、PLB-stathmin/shRNA与PLB-NC/shRNA。3.用BamHⅠ、EcoRI-HF双酶切重组载体PLB-bcl-2/shRNA、PLB-stathmin/shRNA,取重组载体PLB-bcl-2/shRNA酶切大片段和重组载体PLB-stathmin/shRNA酶切小片段连接,获得重组载体PLB-bcl-2-stathmin/shRNA。4.采用阳离子脂质体法将重组载体PLB-bcl-2-stathmin/shRNA、包装质粒△NRF和包膜蛋白质粒pVSVG共转染293FT细胞,根据绿色荧光蛋白测定病毒滴度,转染后48h、72h收集病毒上清,获得重组慢病毒PLB-bel-2-stathmin/shRNA。　　 结果:　　 1.构建出慢病毒干扰载体PLB-bcl-2/shRNA、PLB-stathmin/shRNA和PLB-NC/shRNA(阴性质粒),经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。　　 2.构建出慢病毒干扰载体PLB-bcl-2-stathmin/shRNA,经酶切鉴定、测序证实正确。　　 3.慢病毒干扰载体PLB-bcl-2-stathmin/shRNA、包装质粒△NRF和包膜蛋白粒VSV-G共转染293FT病毒包装细胞后,荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光蛋白表达,表明慢病毒颗粒正确包装。　　 结论:　　 1.成功构建出慢病毒干扰载体PLB-bcl-2/shRNA、PLB-stathmin/shRNA和PLB-NC/shRNA。　　 2.成功构建出慢病毒干扰载体PLB-bcl-2-stathrnin/shRNA。　　 3.完成了PLB-bcl-2-stathmin/shRNA慢病毒载体包装细胞系的建立。