论文部分内容阅读
第一部分颈动脉粥样硬化斑块中差异性lncRNA验证及功能探索背景:颈动脉狭窄疾病在缺血性卒中的病因中高达30%,随着我国人民生活水平的提高和人口结构的老龄化,动脉粥样硬化性颈动脉狭窄已占所有颈动脉狭窄性疾病的90%。由于它起病较缓而不易被早期察觉,患者出现临床症状而没有及时处理往往会留下失语、偏瘫等较严重的后遗症甚至导致死亡。现国内外临床诊疗经验与实验研究发现,即使是相同颈动脉狭窄程度的斑块组织样本,斑块内脂质、血栓及炎症细胞浸润的情况迥然各异,斑块的稳定程度明显不同,这些患者的既往脑梗死情况与再发脑卒中的发生率与斑块的稳定程度密切相关。长链非编码RNA（lncRNA）是指长度大于200nt的不具有编码功能的RNA。虽然已证实lncRNA可以通过影响代谢调控,血管功能,免疫和炎症反应等过程导致动脉粥样硬化的发生和进展,但lncRNA与动脉粥样硬化斑块稳定性之间相互关系的研究却相对较少。目的:本中心前期开展了颈动脉斑块基因组学研究并筛选出稳定性和不稳定性颈动脉粥样硬化斑块中差异表达的lncRNAs及mRNAs。本部分旨在验证高通量测序芯片提示的lncRNAs在稳定性与不稳定性斑块中的差异;探究差异性Lnc-PDHB-1:1与协同物质在特定细胞中发挥功能作用的具体分子机制。方法:1、在通过医院伦理学审查和患者知情同意的前提下,规范化流程收集与处理人体颈动脉粥样硬化斑块标本。按照病理学标准将斑块标本区分为稳定性斑块组和不稳定性斑块组。通过qRT-PCR、PCR与凝胶电泳实验验证高通量测序芯片提示的前9个lncRNAs及共表达分析预测的协同mRNA在稳定性与不稳定性斑块中的差异。2、生物信息学检索lncRNA与协同mRNA的相关性证据。Western blot实验检测mRNA翻译蛋白在稳定性与不稳定性斑块中的含量差异。3、免疫组化定位协同分子与靶分子在稳定性与不稳定性斑块中的分布。结果:1、病理学标准鉴定后使用典型的稳定性与不稳定性斑块各11例。qRT-PCR、PCR与凝胶电泳实验验证高通量RNA芯片中1.5倍差异表达的前9位lncRNAs（lnc-XXbac-BPG116M5.15.4-2:1,lnc-SLC2A14-2:1,lnc-PDHB-1:1,lnc-STARD3NL-6:1,lnc-PTBP3-6:1,lnc-SRPX2-2:1,lnc-METTL6-5:1,lnc-PPM1J-1:1,lnc-POTEG-4:21）,其中Lnc-PDHB-1:1在不稳定性斑块中的表达依旧显著下调（P<0.05）,与前期基因芯片结果一致。共表达分析显示4个mRNAs（Dnase113,Ndufaf4,Spon1,Mllt11）与Lnc-PDHB-1:1存在相关性,其中Dnase113与Lnc-PDHB-1:1存在显著正相关性（P<0.05）。qRT-PCR验证Dnase113在不稳定性斑块中的表达量明显下调（P<0.05）,与前期基因芯片结果一致。2、基于现有的 LncRNA 以及 Gene 数据库（LNCipedia:https://lncipedia.org;UCSC:http://genome.ucsc.edu）,检索 Lnc-PDHB-1:1 的转录基因、Lnc-PDHB-1:1 与 Dnase113基因的碱基序列,确认Lnc-PDHB-1:1的转录基因长度为3161bp;Lnc-PDHB-1:1是一条包含两端元件,长度702bp的核酸序列;而Dnase113基因则是包含7个外显子,长度为18747bp的核酸序列。将Lnc-PDHB-1:1的转录本基因序列（316 1bp）与Dnase1 13的转录本基因序列进行比对（Pubmed,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）,通过碱基序列匹配发现,Lnc-PDHB-1:1转录基因与Dnase113基因中一段包含两个外显子的序列完全互补,明确两者之间确实存在显著相关性。Western blot实验结果显示,不稳定斑块中的Dnase113蛋白含量明显低于稳定性斑块组（P<0.05）。3、免疫组化定位颈动脉斑块标本中的Dnase113与柠檬酸化citH3（巨噬细胞胞外陷阱,METs的组成部分）,两组比较发现:不稳定性斑块中的Dnase113含量明显下调,METs含量显著高于稳定组（P<0.05）。结论:人颈动脉不稳定性斑块中的Lnc-PDHB-1:1显著下调,与其可能存在正向调控关系的协同物质Dnase113在mRNA、蛋白水平均显著下调,而Dnase113可以降解巨噬细胞胞外陷阱（METs）。由此推测Lnc-PDHB-1:1下调后可能导致了后续的Dnase113、METs含量变化,影响了颈动脉斑块的稳定性。第二部分Lnc-PDHB-1:1调控巨噬细胞的功能与机制研究目的:探究Lnc-PDHB-1:1与Dnase113之间的具体调控机制,明确干预Lnc-PDHB-1:1表达对巨噬细胞功能影响。方法:1、原位杂交RNA-Scope技术对Lnc-PDHB-1:1、协同分子Dnase113进行细胞内定位,预测它们之间可能存在的分子机制。2、RNA pull down实验特异性沉降Lnc-PDHB-1:1及与其结合的RNA与蛋白质,通过Western Blot和qRT-PCR验证结合协作关系。3、包装干预细胞内Lnc-PDHB-1:1上调和下调表达的慢病毒,通过慢病毒转染,将人巨噬细胞分为Lnc-PDHB-1:1上调组、Lnc-PDHB-1:1上调阴性对照组,Lnc-PDHB-1:1下调组、Lnc-PDHB-1:1下调阴性对照组和空白对照组,Western Blot和qRT-PCR检测干预Lnc-PDHB-1:1表达后,Dnase113的含量变化;免疫英光观察比较不同组别巨噬细胞内柠檬酸化citH3的含量差异。4、双荧光素酶报告实验验证Lnc-PDHB-1:1与Dnase113之间的具体调控机制。结果:1、原位杂交RNA-Scope技术定位显示:Lnc-PDHB-1:1、Dnase113的荧光信号均定位在细胞质中,且存在部分荧光信号重叠,可能存在结合作用关系。2、RNA pull down 实验结果显示:Lnc-PDHB-1:1 与 Dnase113 在 mRNA 或蛋白层面不存在直接结合作用关系。3、慢病毒干预巨噬细胞后:Lnc-PDHB-1:1过表达,Dnase113表达量也明显上调（P<0.05）;干扰Lnc-PDHB-1:1表达,Dnase113表达量明显下调（P<0.05）。巨噬细胞免疫荧光结果提示,上调Lnc-PDHB-1:1表达后,巨噬细胞内柠檬酸化citH3的含量明显减少（P<0.05）。4、双荧光素酶报告实验结果显示:Lnc-PDHB-1:1通过竞争性结合miR-6866-5P,降低了 miR-6866-5P对Dnase113翻译的抑制作用,从而上调了 Dnase113的表达。结论:本部分证明Lnc-PDHB-1:1竞争性结合miR-6866-5P,上调Dnase113的表达。巨噬细胞内Lnc-PDHB-1:1过表达使Dnase113的表达量上调,可能是通过影响柠檬酸化citH3的合成或降解已合成的柠檬酸化citH3来使METs含量减少的。第三部分 干预Lnc-PDHB-1:1改变颈动脉斑块稳定性的机制研究目的:探究干预Lnc-PDHB-1:1对改变小鼠颈动脉斑块稳定性的效果及机制方法:1、通过生物信息学检索,检测Lnc-PDHB-1:1在人鼠种属中的一致性,qRT-PCR检测Lnc-PDHB-1:1引物的PCR产物、Dnase113在小鼠类单核细胞中的表达量。2、利用C57BL/6J种系ApoE（-/-）的雄性小鼠构建颈动脉粥样硬化斑块模型。包装干预Lnc-PDHB-1:1上调和下调表达的AAV病毒,手术造模后于尾静脉注射转染病毒进行干预,分组设定为:Lnc-PDHB-1:1上调组,Lnc-PDHB-1:1上调阴性对照组,Lnc-PDHB-1:1下调组、Lnc-PDHB-1:1下调阴性对照组和空白对照组。造模结束后取小鼠颈动脉粥样硬化斑块标本,病理学HE染色鉴别稳定性,比较不同组别之间稳定性斑块与不稳定性斑块发生情况存在的差异。3、设计鼠Lnc-PDHB-1:1探针,原位杂交验证病毒转染效率。4、qRT-PCR验证干预Lnc-PDHB-1:1表达、检测Dnase113的含量变化;免疫组化标记小鼠颈动脉斑块内的Dnase113及柠檬酸化citH3,比较不同组别之间的含量差异。结果:1、通过同源序列匹配和Bioedit软件分析得到:鼠源Lnc-XR383076.3与人源Lnc-PDHB-1:1的碱基重合率高达57.7%,关键元件位置及序列基本吻合,转录位点的上下游基因基本重合,均与Dnase113毗邻。2、小鼠造模及病毒干预成功后各组间比较:Lnc-PDHB-1:1下调组小鼠颈动脉管腔狭窄严重甚至闭塞,不稳定性斑块的发生比例明显高于其它组（P<0.05）。3、原位杂交结果表明病毒转染成功。4、qRT-PCR验证:Lnc-PDHB-1:1过表达,小鼠颈动脉斑块中的Dnase113表达量明显上调（P<0.05）;干扰Lnc-PDHB-1:1表达,小鼠颈动脉斑块中的Dnase113表达量明显下调（P<0.05）。免疫组化标记显示小鼠不稳定颈动脉斑块内的柠檬酸化citH3含量明显增多,Dnase113含量显著减少（P<0.05）。结论:干扰巨噬细胞内Lnc-PDHB-1:1表达,上调Dnase113使METs含量减少可以降低不稳定性斑块的发生率。