【摘 要】
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背景与目的:消化系统癌主要包括食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌及肝癌等,最新的《全球癌症负担报告》数据中显示国人发病率排前五的癌症中有三种为消化系统癌（肝癌、胃癌、结直肠癌）,死亡率居前五的癌症中有四种为消化系统癌（肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌）,目前对大多数进展期消化系统癌尚缺乏显著有效的治疗方法。研究发现自然杀伤（Natural killer,NK）细胞作为一种细胞免疫治疗方法,在治疗消化
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背景与目的:消化系统癌主要包括食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌及肝癌等,最新的《全球癌症负担报告》数据中显示国人发病率排前五的癌症中有三种为消化系统癌（肝癌、胃癌、结直肠癌）,死亡率居前五的癌症中有四种为消化系统癌（肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌）,目前对大多数进展期消化系统癌尚缺乏显著有效的治疗方法。研究发现自然杀伤（Natural killer,NK）细胞作为一种细胞免疫治疗方法,在治疗消化系统癌中充当着重要角色,近年来NK细胞过继免疫疗法在恶性肿瘤的临床研究及治疗等方面取得了重大进步,但现阶段由于人体NK细胞的数量相对较低,临床应用治疗和科研试验仍受到一定限制,最新研究显示在脐带血中NK细胞和NK祖细胞的数量比外周血液和骨髓更为丰富,因此本研究拟探讨体外小体积培养脐带血NK细胞的增殖能力及对靶细胞的杀伤效率,筛查脐带血NK细胞活化的关键基因及探究相关分子通路,为NK细胞过继免疫治疗消化系统肿瘤提供可能的理论依据。方法:1、无菌收集6份健康足月孕妇的脐带血进行淋巴细胞分离后小体积体外培养14天,计算细胞量并利用流式细胞仪测定CD3-CD56+细胞比例,满足第14天的CD3-CD56+细胞比例＞80%进行下一步实验。2、ELISA试剂盒检测0天及14天各组细胞的细胞上清液中IFN-γ的含量变化,满足第14天的IFN-γ分泌量＞40ng/m L则进行下一步实验。3、以K562-GFP作为靶细胞,利用流式检测0天及14天各组NK细胞在不同效靶比下对其杀伤效率,满足第14天的杀伤率＞90%进行下一步实验。4、对满足以上条件0天以及14天的样本进行CD3-CD56+细胞分选后施行m RNA转录组测序,对m RNA转录组差异表达基因（Differentially Expressed Gene,DEGs）进行聚类分析,以P值＜0.05为显著差异的分界标准筛选DEGs。5、对筛选的相关DEGs进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。6、利用基因集富集分析（Gene-set enrichment analysis,GSEA）对筛选出DEGs的0天及14天的DEGs进行通路比较。7、通过STRING构建蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）,利用Cytoscape对PPI重构提取其中的核心网络挖掘脐带血NK活化关键DEGs。结果:1、脐带血NK细胞培养至第14天时细胞数明显增加（3.0±0×10~6vs19.733±3.361×10~6）（P＜0.05）,培养14天CD3-CD56+细胞比例（85.700±1.539%）明显高于0天CD3-CD56+细胞比例（33.167±3.014%）（P＜0.05）;2、脐带血NK细胞培养至第14天时ELISA方法检测14天时细胞上清液中IFN-γ的含量（1.370±0.451ng/m L）明显高于0天时IFN-γ的含量（45.700±4.204ng/m L）P＜0.05);3、培养14天时NK杀伤实验流式结果显示效靶比为2:1、5:1、10:1时,NK细胞的杀伤效率明显高于培养0天的NK细胞的杀伤效率（P＜0.05）;4、聚类分析及基因表达水平差异的分布显示0天与14天两组样本间共筛选出7 524个DEGs,其中Up组有3 970个基因,Down组3 554个基因;5、KEGG富集分析显示,大多数与DEGs相关的途径与代谢途径显著相关。GO富集分析表明,Up组DEGs定位于细胞组分或生物发生,而Down组的DEGs主要参与调节免疫反应或免疫系统过程;6、GSEA分析表明NK细胞培养14天相较第0天的DEGs的表达通路中细胞周期、卵母细胞减数分裂及黄体酮介导的卵母细胞成熟、P53信号通路被激活（P＜0.05）,补体凝血级联、造血细胞谱系、氧化磷酸化、核糖体通路受到抑制（P＜0.05）;7、PPI及Cytoscape筛选出10个关键DEGs。结论:1、脐带血NK细胞为期14天的培养后,细胞数量明显增加且杀伤效率得到了加强。2、筛选出10个与脐带血NK活化相关的关键DEGs（RPS27A,CDK1,RPS5,RPS13,CTNNB1,UBA52,RPS11,RPS6,RPS23及RPS15A）,RPS27A,RPS5,RPS13,CTNNB1,RPS11,RPS6,RPS23,RPS15A为下调基因,CDK1,UBA52为上调基因。
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