【摘 要】
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本研究根据GeneBank上公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因及GP5-M复合基因核苷酸序列设计合成两对特异性引物,在两对引物的5’端分别加有限制性内切酶位
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本研究根据GeneBank上公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因及GP5-M复合基因核苷酸序列设计合成两对特异性引物,在两对引物的5’端分别加有限制性内切酶位点。用RT-PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白(N)基因及GP5-M复合基因,扩增出的DNA片段大小与预期的片段大小相符。并将其分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N、pGEX-4T-1-GP5。重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL31(DE3)感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,结果表明得到分子量约为39.866Da的融合蛋白,经超声波破碎处理后,SDS-PAGE电泳分析其为可溶性蛋白,为以后蛋白的大量纯化及后续实验奠定了基础。加有酶切位点的信号肽(SEC)序列由上海生物工程有限公司合成,SEC序列及pGEX-4T-1-GP5质粒同时进行BamHI和EcoRI双酶切,用T4连接酶进行连接,连接产物转化感受态细胞TOP10,得到重组质粒pGEX-4T-1-GP5-SEC。根据真核表达载体pSinRep5的多克隆位点,再重新设计一对引物,并引入Kozak序列,以pGEX-4T-1-GP5-SEC质粒为模板进行PCR扩增,GP5-SEC PCR产物通过酶切连接到真核表达载体pSinRep5上,通过酶切鉴定及测序结果表明真核表达载体已构建成功。
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