[研究背景]二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)属于ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 Poly Unsaturated Fatty Acids, co-3 PUFAs)家族成员。ω-3多不饱和脂肪酸在机体中有很多方面的有益作用,已在多种疾病的预防及治疗方面得到了广泛的应用。其主要有益的作用可概括为：(1)提供能量,作为脂肪乳剂提供机体需要的营养支持；(2)下调炎症细胞因子,减轻SIRS,降低IL-1、TNFα,启到免疫调节的作用；(3)抗炎、减少多器官创伤炎症应激；(4)心血管病的治疗中有降脂、抗凝等有益作用。近来,越来越多的实验证据表明ω-3多不饱和脂肪酸(DHA、EPA)在肿瘤治疗方面有着重要的有益作用。同时,我们前期的研究也从细胞培养及荷瘤小鼠水平证实,ω-3多不饱和脂肪酸(DHA、EPA)可以抑制肿瘤细胞增殖并联合化疗药物达到化疗增敏的作用。[研究目的]在细胞培养水平及荷瘤小鼠水平,研究co-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAs)单用及联合氟尿嘧啶(5-FU)对胃癌治疗作用的影响,在前期研究基础上进一步探讨ω-3PUFA对胃癌治疗作用的机制。第一部分体外实验：细胞培养水平探讨ω-3多不饱和脂肪酸单用及联合氟尿嘧啶对胃癌细胞系作用[细胞培养研究方法]体外实验方法：①首先采用96孔板体外培养细胞,MTT实验检测DHA及5-FU单用或联用对胃癌细胞SGC7901的抑制作用；②使用DCFH-DA活性氧探针检测胃癌细胞SGC7901经DHA及5-FU单用或联用干预后细胞内活性氧的变化情况；③使用荧光素酶双报告基因法检测经DHA及5-FU单用或联用干预后细胞内NF-κB信号通路的激活或抑制情况；④使用RT-PCR方法,检测经药物干预后胃癌细胞NF-κB信号通路下游与肿瘤增殖侵袭相关的基因MMP2、COX2、CyclinDl的mRNA表达的差异；⑤使用Westernblot方法,检测经药物干预后胃癌细胞NF-κB信号通路下游与肿瘤增殖侵袭相关的基因MMP2、COX2、CyclinDl的蛋白表达的差异；⑥使用MDA检测试剂盒检测经药物干预后胃癌细胞内脂质过氧化水平；⑦PI流式细胞分析方法检测DHA及5-FU单用或联用对胃癌细胞周期的影响。[体外实验结果]①MTT实验：DHA及5-FU均可达到抑制肿瘤细胞增殖的作用,DHA联合5-FU化疗可以进一步抑制肿瘤细胞增殖作用,达到化疗增敏的作用。②DCFH-DA活性氧测定：DHA及5-FU均可增加肿瘤细胞内的活性氧产生,DHA联合5-FU化疗可以进一步增加肿瘤细胞内的活性氧产生,达到化疗增敏作用。③NF-κB信号通路双荧光素酶报告基因检测：肿瘤细胞内NF-κB信号通路本身激活明显,DHA可抑制NF-κB信号通路,而5-FU化疗则可激活NF-κB信号通路。DHA联合5-FU化疗可以抑制化疗引起的NF-κB信号通路升高水平。④RT-PCR实验结果：5-FU化疗可激活NF-κB信号通路,并相应使得下游基因与肿瘤增殖侵袭相关的基因MMP2.COX2.CyclinDl的mRNA表达水平升高。联合DHA则可以抑制化疗引起的NF-KB信号通路下游基因MMP2.COX2.CyclinDl的mRNA表达升高水平。⑤Westernblot实验结果：与RT-PCR结果类似,5-FU化疗可激活NF-KB信号通路,并相应使得下游基因MMP2.COX2.CyclinDl的蛋白表达水平升高。联合DHA则可以抑制化疗引起的NF-κB信号通路下游基因MMP2.COX2.CyclinDl的蛋白表达升高水平。⑥MDA测定：DHA可增加肿瘤细胞内的脂质过氧化产物MDA的产生,5-FU化疗则对肿瘤细胞的脂质过氧化产物无明显影响。⑦DHA及5-FU对细胞周期的影响：PI流式细胞分析结果提示DHA能阻滞肿瘤细胞进入S期,5Fu使得S期细胞数量也明显减少,两药联合产生G0／G1期阻滞作用更加明显。各单药组均能降低胃癌细胞株SGC7901的增殖指数,联合用药组降低PI的程度显著强于其余各组(P<0.05)。DHA产生G0／G1期阻滞的作用可能与降低CvclinDl的表达有关。第二部分荷瘤小鼠实验：探讨ω-3多不饱和脂肪酸单用及联合氟尿嘧啶对小鼠前胃癌治疗作用[荷瘤小鼠研究方法]体内实验方法：小鼠前胃癌细胞系(MFC)皮下注射615小鼠构成荷瘤小鼠模型,将荷瘤小鼠分为四组：第1组无干预荷瘤小鼠组,第2组给予口服鱼油干预荷瘤小鼠组,第3组给予化疗干预荷瘤小鼠组,第4组给予口服鱼油及联合化疗干预荷瘤小鼠组。口服鱼油药物为北京百慧制药公司生产的高纯度(DHA、EPA>80%,乙酯型)软胶囊,按每天2g／kg给予小鼠灌胃。化疗方式为临床使用的5-FU静脉注射剂,自皮下种植瘤细胞后每隔两天(20mg／kg)给予一次小鼠腹腔注射治疗,干预14天后处死小鼠。在实验期间仔细记录及检测以下指标：①小鼠一般情况、饮食量及荷瘤小鼠体重的时间变化记录；②肿瘤体积及去瘤小鼠体重的时间变化；③实验结束后,提取各组小鼠肿瘤组织RNA,使用RT-PCR方法比较肿瘤侵袭及增殖相关基因MMP2、COX2、cyclinDl的mRNA表达差异情况：④提取各组小鼠肿瘤组织蛋白,使用Westernblot方法比较肿瘤组织CyclinDl基因蛋白表达差异情况；⑤使用RT-PCR方法比较各组荷瘤小鼠肿瘤组织炎性因子IL-1β. IL-6基因mRNA表达差异情况；⑥提取各组小鼠肿瘤组织蛋白,使用MDA检测试剂盒检测各组荷瘤小鼠肿瘤组织内脂质过氧化水平；⑦小鼠肿瘤组织及肺组织石蜡切片HE染色观察。[体内实验结果]①小鼠一般情况、饮食量及荷瘤小鼠体重的时间变化记录：鱼油干预的小鼠一般情况良好,无明显不适症状；5-Fu腹腔注射化疗本身可明显影响小鼠进食。各组荷瘤小鼠随着肿瘤不断的增长,饮食量也逐渐减少,一般状况也明显恶化,体重明显下降,出现恶液质症状。在给予鱼油的荷瘤小鼠组(第2、4组),较相应的无鱼油干预组(第1、3组),小鼠体重下降程度明显减轻。口服鱼油可以改善肿瘤恶液质。②肿瘤体积及去瘤小鼠体重的时间变化记录：有化疗干预的第3、4组荷瘤小鼠肿瘤体积较第1、2组小鼠肿瘤体积明显要小(P<0.05)。而给予鱼油干预的荷瘤小鼠组(第2组及第4组)相对于无鱼油干预的荷瘤小鼠组(第1组及第4组),小鼠肿瘤体积未见明显的降低(P>0.05)。去瘤小鼠体重与小鼠体重记录相似,在肿瘤明显增大后,各组小鼠的去瘤体重均出现明显降低。在给予鱼油的荷瘤小鼠组,较无鱼油给予组,小鼠去瘤体重明显较高(P<0.05)。③下游基因MMP2、COX2、cyclinDl基因mRNA表达情况：给予鱼油或者化疗干预均抑制了肿瘤组织中COX2、CyclinD1、MMP2的表达(第2、3、4组均较第1组明显降低,p<0.05)。④肿瘤组织CyclinDl基因蛋白表达情况,Westernblot检测：给予鱼油或者化疗干预均抑制了肿瘤组织中CyclinDl的表达(第2、3、4组均较第1组明显降低,p<0.05)。⑤肿瘤组织炎性因子IL-1β、IL-6基因mRNA表达情况：相对于对照组(第1组),在给予化疗或鱼油干预后(第2、3、4组)小鼠瘤组织的IL-1β、IL-6基因表达被强烈抑制(p<0.01)⑥脂质过氧化,MDA检测：给予鱼油明显增加了肿瘤组织中MDA的含量(第2、4组较第1、3组明显增高,p<0.05)。化疗干预组并未明显增加肿瘤组织的MDA含量(第1、3组比较无明显差异,p>0.05)⑦小鼠肿瘤组织及肺组织石蜡切片HE染色观察：各组间小鼠肿瘤组织及肺组织未见明显差异。[本研究结论]1.体外细胞培养水平：ω-3PUFA可以通过抑制NF-KB/IkB信号通路及下游与肿瘤增殖侵袭相关的基因MMP2、COX2、CyclinDl的表达,并可以通过增加细胞内过氧化应激反应达到化疗增敏作用,降低胃癌细胞株SGC7901的PI增殖指数。2.体内荷瘤小鼠水平：ω-3PUFA可以通过降低肿瘤组织表达炎性因子IL-1β、IL-6的表达而改善小鼠恶液质状况；co-3PUFA联合化疗可以在化疗同时,抑制肿瘤增殖侵袭相关的基因MMP2、COX2、CyclinDl的表达,联合co-3PUFA治疗可能对肿瘤化疗有一定的有益作用。3.相对于化疗药物的明显的副作用,ω-3多不饱和脂肪酸同时具有抑炎、调节血脂,以及几乎毫无副作用等优点,本实验结果为临床肿瘤病人应用ω-3PUFA(EPA／DHA)治疗提供了进一步的实验依据。