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研究背景和目的胎儿颈部淋巴水囊瘤（cystic hygroma,CH）是早孕期产前超声扫描常见的异常之一。CH临床表现多样、常合并结构异常、预后较差。CH的发病机制目前尚不完全清楚,在淋巴水囊瘤的发病机制学说中,目前被广泛公认的是淋巴管发育延迟或紊乱。淋巴管的发生、发育大体上包括淋巴管的萌芽、迁移延伸、锚定、淋巴管从血管内皮的剥离、淋巴管的重建与成熟及淋巴结的发育等六个步骤。在胚胎时期,淋巴管网络是由部分静脉内皮细胞发育形成淋巴管内皮祖细胞,并最终迁移发育而成。CH胎儿染色体异常发生率约30%-40%,其中最常见的染色体异常为Turner综合征,其次为21三体、18三体及13三体等常见非整倍体异常。近年发展起来的分子遗传学诊断技术如染色染色体微阵列分析技术（Chromosome Microarray Analysis,CMA）和下一代高通量测序技术/全外显子组测序技术（Whole exome sequencing,WES）能够额外检出5%-15%病例发生了致病性拷贝数变异和/或孟德尔单基因遗传病。但即便如此,也仍有约一半的CH病例病因未明。传统一代Sanger测序和二代NGS高通量测序技术检测的均是待测样本所有细胞混在一起平均化后的DNA碱基序列情况,无法提示细胞类型及其基因表达情况,在研究疾病形成机制方面存在一定的局限性。随着生物技术的不断发展,单细胞转录组测序技术（Single cell RNA sequencing,sc RNA-seq）解决了细胞异质性的问题,可通过对细胞进行分群注释和聚类分析,帮助探究特定细胞群在疾病中的构成情况及其相关表达基因的生物学功能,为深入研究疾病的发生与发展机制提供了直观的视角。本研究通过采用单细胞转录组测序技术对不同遗传学病因相关的CH胎儿病例和正常胎儿病例的颈后皮肤组织进行单细胞转录组测序分析,重点分析与淋巴管发生和发育相关的内皮细胞以探索CH的发病机制。方法1.收集2020年1月至2020年12月于广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心就诊,孕11-13+6周经腹部超声检查诊断为颈部淋巴水囊瘤而接受介入性产前诊断后选择终止妊娠的孕妇及相同孕周因社会因素选择终止妊娠的孕妇。2.所有入组孕妇于本中心终止妊娠,引产后立即收集胎儿颈后皮肤组织样本,产前未行遗传学检测者,需同时取胎儿骨骼肌,按照标准的操作流程进行序列遗传学检测。CH病例组按遗传学病因进一步分为染色体非整倍体组和不明原因组,其中不明原因组定义为分别接受荧光定量PCR（QF-PCR）、染色体微阵列分析（CMA）及全外显子测序分析（WES）均未见异常。3.所有入组病例在遗传学检测后,引产胎儿颈后皮肤组织样本一部分应用于HE染色、免疫荧光以及透射电镜技术进行系统病理分析;一部分应用单细胞RNA测序技术分析,旨在注释和鉴定CH病例颈后皮肤组织细胞类型并绘制细胞图谱,进一步重点对内皮细胞进行深入分析,包括鉴定内皮细胞亚群细胞图谱建立差异基因表达谱,进行差异基因功能分析等以探索CH的发病机制。结果1.本研究共纳入15例样本,其中CH病例组10例,包括18三体（18Trisomy,T18）3例,特纳综合征（Turner Syndrome,TS）4例,原因不明组（Unknown,UK）3例,正常对照组5例。2.病理结果提示CH胎儿病例颈后组织共同的病理表现特征为淋巴管显著增生和扩张,淋巴结增多及坏死,血管减少,间质纤维丝束明显增多、变长,并出现大量细胞浸润组织间隙;免疫荧光分析显示淋巴管异常增生及扩张;透射电镜分析提示细胞间紧密连接减少,细胞连接疏松。3.15例样本均成功进行单细胞转录组测序实验,单细胞转录组测序分析共捕获细胞172,209个,共注释出16种细胞类型,分别是成纤维细胞、内皮细胞、基底细胞、黑素细胞、角质细胞、神经细胞、肌细胞、祖细胞、红细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、NK细胞,成功绘制总体细胞图谱。结合既往文献研究,淋巴管的发育与内皮细胞密切相关,因此在以上细胞类型中,我们重点分析内皮细胞与CH发生之间的联系。根据内皮细胞特异性标记基因（marker gene）将其进一步鉴定得到6类细胞亚群:淋巴管内皮细胞、静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、Stalk-like内皮细胞、Tip-like内皮细胞、肿瘤相关内皮细胞。与正常对照组相比,TS组、T18组和UK组分别在淋巴管内皮细胞亚群、动脉内皮细胞亚群和肿瘤形成相关内皮细胞亚群中细胞比例差异明显,表现为TS组中淋巴管内皮细胞减少;UK组中肿瘤形成相关内皮细胞显著减少;T18组中Stalk-like＆Stem内皮细胞减少。4.进一步筛选得到各个内皮细胞亚群中的差异表达基因共881个,各病例组分别重点选取差异表达最显著的前20个差异表达基因（TOP20）进行深入功能分析。通过分析文献及结合各样本的遗传学结果,我们在不同疾病组中优先重点关注下列差异表达基因:TS组中关注定位于X染色体的差异表达基因,结果只筛选到XIST基因,呈显著下调;T18组中关注定位于18号染色体的差异表达基因,结果只筛选到PTPRM基因,呈显著上调表达;不明原因组中关注基因功能与淋巴管分化及发育相关的差异表达基因,结果只筛选到Hes1基因,呈显著上调表达。进一步针对挑选出来的TOP20差异表达基因进行GO和KEGG生物学功能富集分析,GO富集分析发现在淋巴内皮细胞亚群、静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、Stalk-like内皮细胞、Tip-like内皮细胞和肿瘤相关内皮细胞亚群中分别存在与内皮细胞分化（9）、内皮细胞增殖（4）、细胞外基质组成、细胞与细胞间连接等内皮细胞分化发育过程。KEGG富集分析,发现各内皮细胞亚群中与淋巴管发育相关的通路分别有PI3K-Akt信号通路（5）、Wnt信号通路（4）、TGF-β信号通路、MAPK信号通路、VEGF-C/VEGFR3信号通路、Notch信号通路、Ras/ERK信号通路、TNF信号通路和Hippo信号通路等已知重要信号通路。其中,XIST基因位于Ras/ERK信号通路上,PTPRM基因位于VEGF-VEGFR3信号通路上,Hes1基因位于Notch信号通路上。结论本研究病理分析结果证实淋巴管发育异常及淋巴循环障碍是不同类型淋巴水囊瘤共有的病理生理学基础。首次应用单细胞转录组测序技术对胎儿颈部淋巴水囊瘤进行分析,成功绘制11-13+6周胎儿颈部组织总体细胞图谱。重点分析与淋巴管发育相关内皮细胞,首次鉴定胎儿CH病例颈部组织内皮细胞有六种亚群,并成功绘制内皮细胞图谱。CH胎儿病例颈后皮肤组织中的内皮细胞亚群存在差异,TS组中淋巴管内皮细胞减少;UK组中肿瘤形成相关内皮细胞显著减少;T18组中Stalk-like＆Stem内皮细胞减少。结合差异基因功能分析推测TS组中XIST显著下调及其异常激活的Ras/ERK通路、T18组中PTPRM显著上调及其异常激活的VEGF-C/VEGFR3信号通路、UK组中Hes1基因显著上调及其异常激活的Notch信号通路是分别导致CH发生发展的重要机制。