【摘 要】
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糖蛋白是一类参与多种生理和病理过程的重要生物分子,其在多种生命活动中发挥着重要作用。糖蛋白在体内的异常表达与多种生理病理密切相关,因此被广泛认为是临床诊断的生物标志物之一。在临床诊断中,实现糖蛋白的即时检测（Point of care test,POCT）对疾病的早期诊断和患者生存率的提高具有重要意义。目前,酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,EL
【基金项目】
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国家重点研发计划课题（ 2018YFC1602203、2018YFC1602505）； 国家自然科学基金（31760485）； 南昌大学学科交叉创新基金课题（9166-27060003-ZD01）；
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糖蛋白是一类参与多种生理和病理过程的重要生物分子,其在多种生命活动中发挥着重要作用。糖蛋白在体内的异常表达与多种生理病理密切相关,因此被广泛认为是临床诊断的生物标志物之一。在临床诊断中,实现糖蛋白的即时检测（Point of care test,POCT）对疾病的早期诊断和患者生存率的提高具有重要意义。目前,酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）以其高通量和优异的鲁棒性等独特优势,成为临床诊断中最常见的糖蛋白标志物检测方法。传统的ELISA利用酶-抗体偶联物催化底物产生颜色作为输出信号,灵敏度一般介于ng/m L至μg/m L,同时检测时间较长,因此难以达到即时检测的要求。此外ELISA方法的夹心模式需要一对高度匹配的抗体,成本较高且不易制备。本研究提出了一种基于磁介导单个抗体结合苯硼酸的夹心分析策略,构建了超敏特异性检测糖蛋白的新方法。首先合成了抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体（Human chorionic gonadotropin-monoclonal antibody,HCG-m Ab）功能化的磁性纳米微球（MNB@m Ab）,其可以从复杂样品中分离和浓缩HCG（一种糖蛋白）;以4-氨基苯硼酸（4-APBA）修饰的量子点荧光微球（Quantum beads,QBs）形成的QB@4-APBA为检测探针结合糖蛋白上的顺式二醇,从而实现荧光信号输出。在最优的条件下,该方法检测HCG的最低检测限（Limit of detection,LOD）为0.19 m IU/m L（传统ELISA的灵敏度为7.6 m IU/m L）,定量检测线性范围为0.24-62.5 m IU/m L,线性回归方程为y=21.858ln（x）+35.832（R~2=0.9747）;该方法检测血清中HCG用时40 min,较传统ELISA方法缩短一倍左右;特异性实验结果显示,该方法在检测目标物与其他常见生物标记物、糖类及其衍生物时无明显的交叉反应;批间及批内加标回收实验结果显示,该方法检测血清中HCG的平均回收率为94.77%-114.9%,变异系数为0.41%-9.19%,表明具有良好的准确度;进一步将该方法检测结果与商业化化学发光免疫分析试剂盒（Chemiluminescence immunoassay kit,CLIA）检测结果进行对比,显示两者具有较好的一致性。在此基础上,通过整合动态光散射技术,进一步建立了基于苯硼酸诱导纳米粒子聚集的动态光散射免疫传感器（Phenylboronic acid-induced nanoaggregate based dynamic light scattering sensor,PINA-DLS sensor）,实现了血清中糖蛋白的超灵敏检测。首先合成了抗甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）单克隆抗体功能化的磁性纳米微球（MNP@m Ab）,MNP@m Ab可从复杂样品中分离和浓缩AFP形成免疫复合物MNP@m Ab-AFP;以八臂PEG聚合物为载体合成八臂苯硼酸（八臂PBA）,并以其为结合糖蛋白的苯硼酸交联剂（Phenylboronic acid crosslinker,PAC）实现MNP@m Ab-AFP的聚集,通过粒径分析仪记录反应前后的流体动力学直径（Diameter of hydrodynamic,DH）,根据阳性与阴性样品DH的变化实现对糖蛋白的定量检测。在最优的条件下,该方法检测AFP的最低检测限为0.33pg/m L,定量线性范围为0.48-125 pg/m L,批间及批内实验的平均回收率为87.86%-119.48%,变异系数为1.91%-13.56%。将本方法进一步拓展至其他糖蛋白的检测（NT-pro BNP和HCG）,结果显示该方法检测NT-pro BNP的最低检测限为14 fg/m L,定量线性范围为0.0156-8 pg/m L;检测HCG的最低检测限为0.17m IU/m L,定量线性范围为0.24-50 m IU/m L。特异性实验结果显示,该方法与其他常见生物标记物、糖类及其衍生物时无明显的交叉反应,进一步将该方法检测结果与商业化检测结果对比,结果表明两种方法具有良好的一致性。此外,该检测方法整体检测过程仅需15 min。由于所建方法具有较好的检测灵敏度、特异性以及较短的检测时间,因此该方法是一种具有广泛应用前景的糖蛋白POCT高灵敏检测方案。
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