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缺血性脑卒中的发生是由脑部血液供应不足造成的，目前主要的治疗手段是恢复血液再灌注，但是在这一过程中会进一步加重脑组织损伤，这种病理生理改变称为脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤。由于其发生机制复杂，近年来对脑I/R损伤的病理生理机制及如何减轻这一损伤成为研究的热点。
研究表明，P2X7受体受到抑制时可发挥抗脑I/R损伤的作用，但其作用机制仍需要进一步的研究。线粒体是为细胞提供能量的动态细胞器，在正常状态下处于融合与裂变的平衡之中。但当发生I/R损伤时，其动态平衡会遭到破坏并趋向于裂变，从而加重损伤。研究表明AMP-activatedproteinkinase(AMPK)可以调节线粒体的融合与裂变，且在酒精性肝病中抑制P2X7受体可以增强AMPK的活性。但在小鼠脑I/R损伤中，抑制P2X7受体与AMPK是否存在相似的作用尚未有文献报导。因此，本研究采用在体和离体两部分实验来探讨AMPK介导的线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗小鼠脑I/R损伤中的作用及具体的作用机制。
目的：
探讨AMPK介导的线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗小鼠脑I/R损伤中的作用。
方法：
1.成年雄性ICR小鼠随机分为假手术(sham)组、脑缺血/再灌注(I/R)组、脑缺血/再灌注+BBG(BrightBlueG，P2X7受体抑制剂；I/R+BBG)组、脑缺血/再灌注+BBG+Dorsomorphin(AMPK抑制剂，I/R+BBG+Dorsomorphin)组。小鼠脑I/R损伤模型参照大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)法制备，缺血1h，再灌注24h。小鼠神经行为学进行评分采用Longa五分法评估；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法检测小鼠脑梗死体积；采用透射电镜(transmission electron microscopy TEM)法检测线粒体的融合与裂变；采用westernblot法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2的蛋白表达。
2.体外：从ICR胎鼠脑组织中提取神经元细胞进行培养。制备神经元缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤模型，并将细胞分为对照(control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+BBG(H/R+BBG)组、缺氧/复氧+BBG+Dorsomorphin(H/R+BBG+Dorsomorphin)组。采用Calcein-AM双染法检测神经元细胞的存活率；采用活性氧(reactive oxide species, ROS)试剂盒检测各组细胞ROS的含量；采用MitoTrackerTMGreenFM试剂盒检测神经元细胞线粒体融合与裂变的情况；采用westernblot法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2的蛋白表达。
结果：
1.神经行为学结果表明，sham组小鼠行为学评分为0，但其神经行为学评分明显增加当小鼠发生脑I/R损伤时；与I/R组相比，在使用BBG之后，小鼠的神经行为学评分明显降低；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，小鼠的神经行为学评分又明显增加。
2.脑梗死体积百分率结果表明，sham组小鼠无脑梗死体积，但当小鼠发生I/R损伤时其脑梗死体积百分率显著增加；与I/R组相比，在使用BBG之后，小鼠的脑梗死体积百分率明显减小；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，小鼠的脑梗死体积百分率又显著增加。
3.透射电镜结果表明，当小鼠发生脑I/R损伤时，其大脑皮层组织线粒体的周长、圆度和径长比均降低，而与I/R组相比，在使用BBG之后，小鼠大脑皮层组织线粒体的体周长、圆度和径长比均增加；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，小鼠大脑皮层组织中线粒体的体周长、圆度和径长比又均增加。
4.Westernblot结果显示，与sham组相比，I/R组p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加；与I/R组相比，在使用BBG之后，p-AMPK、Mfn2的表达增加而p-Drp1的表达降低；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达则增加。
5.Calcein-AM双染法结果显示，当神经元发生H/R时死亡率明显增加，与control组相比；但在使用BBG之后，与H/R组相比，神经元细胞死亡率则明显降低；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，神经元细胞死亡率又明显增加。
6.ROS检测结果显示，与control组相比，H/R组活性氧含量明显增量，但与H/R组相比，在使用BBG之后，活性氧含量则明显降低；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，活性氧含量又明显增加。
7.激光共聚焦显微镜观察结果表明，当发生H/R时，与control组相比，神经元细胞线粒体裂变明显增加而融合减少；但在使用BBG之后，与H/R组相比，神经元细胞线粒体的裂变减少而融合增多；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，神经元细胞线粒体的裂变又明显增多而融合减少。
8.Westernblot结果显示，与control组相比，H/R组p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加；与H/R组相比，在使用BBG之后，p-AMPK、Mfn2的表达增加而p-Drp1的表达降低；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加。
结论：
1.在小鼠脑I/R损伤中抑制P2X7受体可以抑制线粒体裂变、促进线粒体融合。
2.抑制P2X7受体可以通过增加p-AMPK的表达从而减轻小鼠脑I/R损伤。
3.抑制P2X7受体可以通过调控AMPK抑制线粒体裂变、促进线粒体融合来减轻小鼠脑I/R损伤。
研究表明，P2X7受体受到抑制时可发挥抗脑I/R损伤的作用，但其作用机制仍需要进一步的研究。线粒体是为细胞提供能量的动态细胞器，在正常状态下处于融合与裂变的平衡之中。但当发生I/R损伤时，其动态平衡会遭到破坏并趋向于裂变，从而加重损伤。研究表明AMP-activatedproteinkinase(AMPK)可以调节线粒体的融合与裂变，且在酒精性肝病中抑制P2X7受体可以增强AMPK的活性。但在小鼠脑I/R损伤中，抑制P2X7受体与AMPK是否存在相似的作用尚未有文献报导。因此，本研究采用在体和离体两部分实验来探讨AMPK介导的线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗小鼠脑I/R损伤中的作用及具体的作用机制。
目的：
探讨AMPK介导的线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗小鼠脑I/R损伤中的作用。
方法：
1.成年雄性ICR小鼠随机分为假手术(sham)组、脑缺血/再灌注(I/R)组、脑缺血/再灌注+BBG(BrightBlueG，P2X7受体抑制剂；I/R+BBG)组、脑缺血/再灌注+BBG+Dorsomorphin(AMPK抑制剂，I/R+BBG+Dorsomorphin)组。小鼠脑I/R损伤模型参照大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)法制备，缺血1h，再灌注24h。小鼠神经行为学进行评分采用Longa五分法评估；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法检测小鼠脑梗死体积；采用透射电镜(transmission electron microscopy TEM)法检测线粒体的融合与裂变；采用westernblot法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2的蛋白表达。
2.体外：从ICR胎鼠脑组织中提取神经元细胞进行培养。制备神经元缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤模型，并将细胞分为对照(control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+BBG(H/R+BBG)组、缺氧/复氧+BBG+Dorsomorphin(H/R+BBG+Dorsomorphin)组。采用Calcein-AM双染法检测神经元细胞的存活率；采用活性氧(reactive oxide species, ROS)试剂盒检测各组细胞ROS的含量；采用MitoTrackerTMGreenFM试剂盒检测神经元细胞线粒体融合与裂变的情况；采用westernblot法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2的蛋白表达。
结果：
1.神经行为学结果表明，sham组小鼠行为学评分为0，但其神经行为学评分明显增加当小鼠发生脑I/R损伤时；与I/R组相比，在使用BBG之后，小鼠的神经行为学评分明显降低；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，小鼠的神经行为学评分又明显增加。
2.脑梗死体积百分率结果表明，sham组小鼠无脑梗死体积，但当小鼠发生I/R损伤时其脑梗死体积百分率显著增加；与I/R组相比，在使用BBG之后，小鼠的脑梗死体积百分率明显减小；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，小鼠的脑梗死体积百分率又显著增加。
3.透射电镜结果表明，当小鼠发生脑I/R损伤时，其大脑皮层组织线粒体的周长、圆度和径长比均降低，而与I/R组相比，在使用BBG之后，小鼠大脑皮层组织线粒体的体周长、圆度和径长比均增加；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后，小鼠大脑皮层组织中线粒体的体周长、圆度和径长比又均增加。
4.Westernblot结果显示，与sham组相比，I/R组p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加；与I/R组相比，在使用BBG之后，p-AMPK、Mfn2的表达增加而p-Drp1的表达降低；但与I/R+BBG组相比，在抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达则增加。
5.Calcein-AM双染法结果显示，当神经元发生H/R时死亡率明显增加，与control组相比；但在使用BBG之后，与H/R组相比，神经元细胞死亡率则明显降低；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，神经元细胞死亡率又明显增加。
6.ROS检测结果显示，与control组相比，H/R组活性氧含量明显增量，但与H/R组相比，在使用BBG之后，活性氧含量则明显降低；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，活性氧含量又明显增加。
7.激光共聚焦显微镜观察结果表明，当发生H/R时，与control组相比，神经元细胞线粒体裂变明显增加而融合减少；但在使用BBG之后，与H/R组相比，神经元细胞线粒体的裂变减少而融合增多；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，神经元细胞线粒体的裂变又明显增多而融合减少。
8.Westernblot结果显示，与control组相比，H/R组p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加；与H/R组相比，在使用BBG之后，p-AMPK、Mfn2的表达增加而p-Drp1的表达降低；而与H/R+BBG组相比，在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后，p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加。
结论：
1.在小鼠脑I/R损伤中抑制P2X7受体可以抑制线粒体裂变、促进线粒体融合。
2.抑制P2X7受体可以通过增加p-AMPK的表达从而减轻小鼠脑I/R损伤。
3.抑制P2X7受体可以通过调控AMPK抑制线粒体裂变、促进线粒体融合来减轻小鼠脑I/R损伤。