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背景针对自身免疫性疾病以及恶性肿瘤的治疗尚无疗效较好且副作用较少的方法或药物,近年来的研究表明,在上述疾病的发生、发展过程中,抗原特异性T细胞起一定作用。CTLA4作为一种主要的共刺激信号负调节分子,具有阻断T细胞活化的作用;作为CTLA4的单克隆抗体则具有激活T细胞的作用,二者通过对T细胞的调控作用,干预机体免疫微环境,开辟了对上述疾病的新的治疗途径。目的本研究目的在于获得高纯度的细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(extracellular domain of cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,ex CTLA4)。通过构建ex CTLA4重组表达质粒,并在大肠杆菌Transetta(DE3)中进行重组蛋白的表达。以期获得高纯度的ex CTLA4重组蛋白,为研究其生物学功能或制备人源化的CTLA4单克隆抗体提供基础。方法1.构建原核表达质粒p ET-28a-ex CTLA4。根据人源CTLA4基因序列由公司合成胞外域序列,以此序列为模板,扩增后并构建到p ET-28a载体的相应酶切位点。2.诱导表达ex CTLA4重组蛋白。将测序正确的表达质粒转化至大肠杆菌Transetta(DE3)中,在诱导物IPTG浓度为0.5m M、诱导温度为37°C时,诱导菌体表达蛋白,培养4h后收集菌体,SDS-PAGE检测菌体中的重组蛋白有无表达。3.优化ex CTLA4重组蛋白表达条件。从诱导物浓度IPTG,诱导温度,诱导时间三方面诱导条件进行优化。并在此基础上,设计三水平三因素正交试验,选择最优表达条件。4.纯化ex CTLA4重组蛋白。选择最优条件诱导目的蛋白表达,收集菌体后,超声破碎菌体并收集包涵体,先用低浓度尿素(2M)洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8M)溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度ex CTLA4。5.梯度稀释法复性ex CTLA4重组蛋白。用复性缓冲液梯度稀释样品,并经过透析可将变性的重组蛋白复性。6.检测重组蛋白ex CTLA4的生物学活性。利用CTLA4的配体B7-1以及外周血单核细胞(PBMC),通过相应ELISA试剂盒检测ex CTLA4的生物学活性。结果1.成功构建表达质粒p ET-28a-ex CTLA4,测序后序列与已知序列经BLAST比对完全一致。2.成功诱导重组蛋白的表达,获得了ex CTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在0.75m M IPTG、25°C下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在。3.通过镍离子亲和层析纯化及复性获得高纯度重组蛋白,经Western blot鉴定为CTLA4。4.经过ELISA检测鉴定,纯化的ex CTLA4具有生物学活性。结论本研究构建了ex CTLA4重组表达质粒,获得了ex CTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件以及最佳优化结果,得到了具有生物学活性的重组蛋白,为该蛋白的应用以及后期的抗体筛选奠定了基础。