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牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea, BVD)又称黏膜病(Mucosal disease, MD),是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的以繁殖障碍、胎儿畸形及免疫抑制为特征的一种传染病。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属,与其同属的病毒还有猪瘟病毒(CSFV)和羊边界病毒(BDV)。BVDV呈世界性分布,在欧美等许多养牛业发达国家尤其严重,给全球养牛业带来巨大经济损失。牛病毒性腹泻病在我国流行并导致巨大经济损失,因此研究有效的BVDV诊断方法具有很重要的经济意义。牛病毒性腹泻病毒E0蛋白是病毒粒子表面最保守糖蛋白之一,能诱导中和抗体的产生。根据已发表的BVDV的VEDEVAC株的全基因组序列设计1对扩增E0的引物,经RT-PCR扩增出长约680bp的E0基因片段,将目的基因克隆到pET-30a载体上,经酶切鉴定获得阳性重组质粒后进行测序。将测序正确的阳性重组质粒转化BL21表达菌,经扩大培养及IPTG诱导后获得以包涵体形式存在的重组E0蛋白。重组E0蛋白经亲和层析法纯化后,经免疫印迹证实其具有良好的反应性。用纯化的重组E0蛋白免疫BALB/c小鼠,通过小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合而获得杂交瘤细胞,经过4次亚克隆后获得4株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1E6、3C3、3F4、3F7。用杂交瘤细胞分别接种小鼠制备腹水,用纯化病毒测的腹水效价分别为4×104、3.2×105、3.2×105、2×104。经鉴定4株单克隆抗体均为IgGl/λ,间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)表明4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有良好的反应性和特异性。同时用重组E0蛋白免疫新西兰大白兔获得重组E0蛋白多克隆抗体,间接免疫荧光实验证明该多克隆抗体具有特异性,且抗体1:400倍稀释后仍然能够检测到特异性荧光,与牛的其他疾病牛传染性鼻气管炎、牛副流感病毒3型和牛腺病毒3型等不反应,而且所制备的兔源多抗而且具有中和活性,可试用于BVDV中和试验。为了研究BVDV实验感染小鼠在体内增殖情况,使用BVDV的BA株经滴鼻途径接种小鼠,通过RT-PCR、病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫组化检测,证实了BVDV对5周龄的BALB/c小鼠有一定的致病性。检测结果表明,接种后24小时内BVDV在血液中增殖,24小时后即可在肺脏中检测出病毒的存在。病理组织学观察显示肺脏以肺泡间隔增宽为主。病毒分离培养实验、RT-PCR、免疫组化检测表明BVDV在小鼠肺脏中能够复制,以上结果说明BVDV可以实验感染BALB/c小鼠。综上所述,本研究成功表达了BVDV的E0蛋白,用纯化的重组病毒制备了4株针对E0蛋白的单克隆抗体；同时用重组E0蛋白免疫家兔制备了兔源多抗,该多抗具有中和活性。BVDV的E0的单抗与多抗制备为建立以检测E0蛋白夹心ELISA奠定了基础。此外,利用BVDV的BA株经滴鼻接种对BALB/c小鼠进行实验感染的研究。经病原检测及病理组织学检查证实了BVDV可在小鼠体内增殖,对小鼠有一定的致病性,为BVDV的实验感染模型的建立奠定了基础。