论文部分内容阅读
目的：原发性肝内胆管结石(Primary intrahepatic stone，PIS)是指左右肝管汇合部以上各分枝胆管内的结石。其发病机制可能与机体营养状况、胆道感染、胆道狭窄、胆汁代谢、成分失衡等因素有关，但确切发病机制尚不明确。研究显示胆汁中胆汁酸浓度在肝内胆管结石组较正常对照组明显降低，说明胆汁酸可能在PIS的形成中起重要作用。瘦素作为腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosinemonophosphate–activated protein kinase, AMPK)活化的上游因子之一，在机体能量代谢及调控等多方面起重要作用。近来研究表明AMPK可调控胆盐输出泵（Bile salt export pump, BSEP）蛋白的表达，而BSEP是将肝细胞内胆汁酸泵入胆小管重要通道，可调控胆道胆汁酸的浓度；因此，本课题探讨瘦素对HepG2细胞BSEP蛋白表达的影响及作用机制，进一步从代谢途径阐述肝内胆管结石的发病机制并可能为肝内胆管结石提供新的治疗方案。方法：瘦素作为刺激因子，将体外培养HepG2细胞分为4个组：正常对照组（nomal control，NC组：培养基不含瘦素），10-8mol/L瘦素组（control，CT1组，培养基含10-8mol/L瘦素），10-7mol/L瘦素组（CT2组，培养基含10-7mol/L瘦素），10-6mol/L瘦素组（CT3组，培养基含10-6mol/L瘦素），将CT1、CT2、CT3组分别培养24H（CT1.1、CT2.1、CT3.1）、48H（CT1.2、CT2.2、CT3.3）、72H（CT1.3、CT2.3、CT3.3）后用Western-blot检测瘦素长型受体（leptin recptor B，LepRb）、AMPKa、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶a2亚基(p-AMPKa)、BSEP蛋白水平；取细胞培养上清液分别测定谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，AST）、总胆汁酸（totalbile acid，TBA）及前白蛋白（Prealbumin, PA）含量；比较不同时间及瘦素刺激点，将BSEP表达最强点作为RB组（培养基含10-6mol/L瘦素+10umol/LAMPK阻断剂Compund C），用Western-blot检测BSEP蛋白表达。结果：1.与正常组比较，在瘦素刺激HepG2细胞24H、48H时，上清液中ALT、AST量均增加，和瘦素浓度（10-6mol/L、10-7mol/L）呈正相关（P<0.05），但在72H和瘦素浓度为10-8mol/L时与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05），瘦素增加上清液中TBA、PA的含量（P<0.05）；2.与正常组比较，不同浓度瘦素干预HepG2细胞24H时，10-8mol/L瘦素浓度组LepRb蛋白表达增加但差异无统计学意义（P>0.05），随浓度增高LepRb蛋白表达逐渐减弱（P>0.05）；48H、72H时测得LepRb蛋白表达呈时间和剂量依赖性逐渐增高，在72H时，瘦素浓度为10-6mol/L时LepRb蛋白表达最强，与正常对照组及其余干预组比较均明显增高差异有统计学意义（P<0.05）；3.不同浓度瘦素干预HepG2细胞24H及48H，AMPK a2蛋白表达量无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），但在72H时，随瘦素浓度增高AMPKa蛋白表达量逐渐增高，在瘦素浓度为10-6mol/L时AMPKa蛋白表达最强，同NC组比较差异有统计学意义（P<0.05）；4.24H测得各组p-AMPKa蛋白表达量较NC组均降低，且随瘦素浓度增高而降低，但同正常组及组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；48H后AMPKa磷酸化水平呈时间和剂量依赖逐渐增强，72H时同NC组比较差异有统计学意义（P<0.05）；24H、48H、72H时相同瘦素浓度组p-AMPKa蛋白表达量逐渐增加，CT3.3组同CT3.1、CT3.2组比较差异有统计学意义（P<0.05）；5.24H测得各组BSEP蛋白表达量较NC组均增加，且随浓度增高而降低，但同正常组及组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；48H后BSEP蛋白表达量逐渐增加，CT3.2组及CT3.3组同NC组比较差异有统计学意义（P<0.05）；24H、48H、72H时相同瘦素浓度组BSEP蛋白表达量逐渐增加，CT3.3组同CT3.1、CT3.2组比较差异有统计学意义（P<0.05）；6.72H测得CT3组、RB组BSEP蛋白表达较NC组均增加（P<0.05），RB组BSEP蛋白表达较CT3组降低（P<0.05）。结论：1.瘦素可通过“Leptin-AMPK-SRC2-FXR-BSEP”途径促进HepG2细胞BSEP蛋白表达；2. Leptin干预HepG2细胞24H时可降低LepRb蛋白表达及AMPKa2磷酸化水平，但24H以后瘦素呈剂量和时间依赖性促进LepRb蛋白的表达及AMPKa磷酸化水平；3. Leptin干预HepG2细胞72H时可促进AMPKa蛋白表达；4. Leptin可促进HepG2细胞前白蛋白及胆汁酸的分泌，为瘦素在PIS的可能发病机制及治疗中提供理论基础。