夹脊电针调控P2X7R/NLRP3信号通路相关因子抑制ASCI炎症损伤作用机制的实验研究

来源 :黑龙江中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:suzuzl
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目的:通过对夹脊电针干预急性脊髓损伤模型大鼠运动功能及P2X7R/NLRP3信号通路相关因子表达影响的实验研究,探究夹脊电针对大鼠运动功能及脊髓组织中P2X7R/NLRP3信号通路相关因子表达的影响,阐明夹脊电针对脊髓损伤治疗的作用机制。方法:本研究共分两部分实验。实验一:夹脊电针对ASCI大鼠行为学改变的影响。实验选用72只雌性SD大鼠,按照随机数字表法分为3组:分别是假手术组(Sham组)、模型组(Model组)和夹脊电针组(EA组),每组又根据夹脊电针干预治疗的时间分为1d、3d、7d、21d四个亚组,每亚组6只。Sham组大鼠仅通过手术去除椎板暴露脊髓;Model组大鼠采用Allen’s打击法制备ASCI模型;夹脊电针组大鼠在Model组大鼠制备基础上给予夹脊电针治疗。各亚组分别于造模后和治疗时间结束后,运用BBB评分评估各组大鼠肢体运动功能变化。实验二:夹脊电针对ASCI大鼠脊髓组织P2X7R/NLRP3信号通路相关因子表达的影响。将120只雌性SD大鼠按照随机数字表分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、夹脊电针组(EA)、NLRP3干扰组(NLRP3si RNA)和干扰对照组(Controlsi RNA),每组根据不同时间点分为1d、3d、7d、21d四个亚组,每个亚组6只。Sham组仅暴露大鼠脊髓;Model组采用改良Allen’s打击法制备大鼠SCI模型;夹脊电针组于模型制备基础上给予夹脊电针治疗,NLRP3干扰组在成功损伤脊髓后注射NLRP3si RNA干扰病毒,干扰对照组于模型制备基础上采用相同手段注射阴性对照病毒,在各时间点,治疗结束后处死取材,应用IHC法检测各组大鼠脊髓组织NLRP3、P2X7R、IL-1β、IL-18的表达情况;运用免疫荧光双染法观察P2X7R、NLRP3与OX42共定位情况;运用Western-blot检测各组大鼠脊髓组织NLRP3和P2X7R蛋白表达;运用Realtime-PCR法检测各组大鼠脊髓组织NLRP3m RNA、P2X7Rm RNA的表达。结果:1.BBB评分比较:与Sham组比较,各时间点Model组大鼠BBB评分显著降低,差异有统计学意义(P(27)0.05);与Model组大鼠比较,术后3d、7d、21d EA组大鼠BBB评分均升高,差异有统计学意义(P(27)0.05)。随着时间推移,EA组与Model组大鼠BBB评分随时间呈现上升趋势,EA组上升幅度高于Model组。2.免疫组化检测各组大鼠脊髓组织中NLRP3、P2X7R、IL-1β和IL-18阳性细胞的表达:术后1d、3d、7d,Model组大鼠脊髓组织中NLRP3、P2X7R、IL-1β、IL-18的阳性细胞的表达持续升高,在21d时有所回落,与sham组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后3d、7d,21d,EA组脊髓组织中NLRP3与P2X7R阳性细胞的表达明显下降,与Model组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后7d、21d时间点,EA组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-18阳性细胞的表达明显下降,与Model组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后3d,7d,21d,si RNA组脊髓组织中NLRP3、P2X7R、IL-1β和IL-18的阳性细胞表达下降,与Model组和Controlsi RNA组相比,均差异具有统计学意义(P<0.05)。3.免疫荧光双染法检测各组大鼠脊髓组织中NLRP3与OX42的细胞定位表达:在模型组和干扰对照组脊髓组织中,术后3d,7d,21d,OX42表达增多,NLRP3与OX42的共表达均增多,荧光变强;夹脊电针组和NLRP3干扰组脊髓组织中,术后3d,7d,21d,OX42表达较少,NLRP3/OX42共表达均较少,荧光较弱。P2X7R与OX42的表达趋势与NLRP3相同。4.Western blot检测各组大鼠脊髓组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达:术后1d、3d、7d,Model组大鼠脊髓组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达持续升高,在21d时有所回落;术后3d、7d、21d时间点,Model组与Sham组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后7d、21d时间点,EA组大鼠脊髓组织中NLRP3、P2X7R蛋白的表达明显下降,与Model组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后3d,7d,21d,si RNA干扰组脊髓组织中NLRP3、P2X7R蛋白表达下降,与Model组和Controlsi RNA组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5.RT-PCR法检测各组大鼠脊髓组织中NLRP3m RNA、P2X7Rm RNA的表达:术后1d,3d,7d,21d的时间点,Model组大鼠的脊髓组织中NLRP3m RNA表达升高,与Sham组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后3d,7d,21d时间点,EA组大鼠脊髓组织中NLRP3的基因表达下降,与Model组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后1d,3d,7d,21d,si RNA干扰组脊髓组织中NLRP3m RNA、P2X7Rm RNA基因表达明显降低,与Model组和Controlsi RNA组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.夹脊电针能减轻ASCI后大鼠脊髓组织炎症反应,改善SCI大鼠运动功能;2.夹脊电针能抑制P2X7R、NLRP3蛋白的表达,减少促炎因子IL-1β、IL-18的释放;3.质粒病毒装载si RNA干扰NLRP3表达,降低NLRP3m RNA分子水平,抑制NLRP3蛋白在小胶质细胞中表达,减少促炎因子的分泌,改善SCI大鼠脊髓组织炎性损伤;4.夹脊电针可能通过抑制P2X7R/NLRP3蛋白及基因在小胶质细胞中的表达,进而减少促炎因子的分泌,改善SCI大鼠脊髓组织炎性损伤。
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