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黄曲霉毒素(Aflatoxin)和赭曲霉毒素(Ochratoxin)均是多种曲霉菌和青霉菌产生的真菌毒素,这些真菌毒素作为次级代谢物长期存在并持续污染食品和动物饲料等。黄曲霉毒素已被国际癌症研究机构确认为有害的致癌物质,黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)被认为是第一类致癌物,其靶器官是肝脏。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是人类巴尔干地方性肾病的一种潜在致癌物,是一种2B型潜在致癌物,OTA的靶器官是肾脏。AFB1和OTA均能引起肾毒性、肝毒性和免疫毒性等,且在谷物以及动物饲料中AFB1和OTA的共同污染是非常常见的问题,但关于AFB1和OTA联合暴露及其机理研究方面少有深入探讨。硒是各种生命体所必需的一种微量元素,是谷胱甘肽过氧化酶的必需成分,而硒蛋氨酸(Selenomethionine,SeMet)作为有机硒的一种,能够促进硒在人体中的吸收效率和生物利用度,从而清除氧化自由基等。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是细胞内还原性谷脱甘肽(glutathione,GSH)的前体,而GSH是一种公认的抗氧化剂,由于其不能直接添加于机体产生作用,所以还原性谷胱甘肽的前体物质NAC便被应用于机体从而发挥抗氧化作用。研究报道,SeMet和NAC均具有抵抗细胞凋亡、氧化应激反应等功能。目前虽有诸多关于硒和NAC的研究报道,但在多种毒素暴露于猪免疫细胞时,关于SeMet和NAC联合保护作用未见报道。本论文主要对AFB1和OTA两种毒素诱导的猪肺泡巨噬细胞免疫毒性和氧化应激及其机制的研究,对SeMet和NAC联合保护AFB1和OTA诱导的氧化应激和免疫毒性的机理进行了探讨。试验一.黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A对猪肺泡巨噬细胞的联合毒性作用及其机制研究本试验的主要研究目的是探讨AFB1和OTA对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)的联合毒性作用及其机制。本试验中应用了猪肺泡巨噬细胞系3D4/21为模型,以8×103、1×105、2×105的细胞量分别接种于96孔板、12孔板和6孔板,在37℃、含有5%CO2的培养箱中培养。通过MTT法测定了细胞分别与AFB1和OTA共同培养48 h的半数致死量(IC50),同时测定10%-50%的半数致死量进行联合。应用激光共聚焦和流式细胞仪观察和测定了毒素暴露后细胞的凋亡和ROS水平。同时,应用中性红吞噬法和real-time PCR测定了毒素暴露后巨噬细胞的吞噬指数以及TNF-a、IL-6的mRNA表达水平。为了研究其中的信号通路,应用western blotting测定了 IκBα、p65和p-p65的蛋白表达水平。结果表明,AFB1和OTA的半数致死量分别是0.8μg/mL和2 μg/mL,当 AFB1浓度为 0.16 μg/mL(20%*IC50)和 OTA 浓度为 0.4 μg/mL(20%*IC50)联合时,能显著降低细胞活力、升高LDH的活性并诱导3D4/21细胞凋亡,显著降低3D4/21细胞的吞噬能力,使TNF-a和IL-6的释放增加,诱导细胞产生氧化应激,显著升高ROS水平降低GSH的产生。添加抗氧化剂NAC后,能显著逆转毒素诱导的氧化应激和免疫毒性。此外,western blotting显示,AFB1和OTA的联合作用能显著促进IκBα的降解、NFκB(p65)的磷酸化。NFκB的抑制剂BAY 11-7082 在对细胞无显著毒性的浓度时,能够逆转以上效果。由此可以得出结论,AFB1和OTA的联合可通过激活NFκB信号通路而加重免疫毒性。试验二.硒蛋氨酸和N-乙酰半胱氨酸缓解黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A诱导的氧化应激和免疫毒性作用及其机制研究硒蛋氨酸(SeMet)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)具有抗炎和抗氧化活性。我们之前的研究表明,黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)可以诱导免疫毒性和氧化应激。本研究的主旨是确定SeMet和NAC的联合保护作用和潜在机制。在这项研究中,SeMet和NAC显著缓解了 AFB1和OTA联合诱导猪肺泡巨噬细胞的细胞活力、谷胱甘肽和吞噬作用的下降。添加SeMet和NAC降低了乳酸脱氢酶(LDH)活性、凋亡、caspase3蛋白表达水平、活性氧(ROS)水平和促炎细胞因子(TLR4,TNF-a和IL-6)表达的上升趋势。结果表明,SeMet和NAC能够减缓AFB1和OTA诱导的氧化应激和免疫毒性,且二者低剂量的联合保护作用显著高于单独使用。SeMet和NAC有效联合保护浓度确定后,为了分析不同的MAPKs蛋白的磷酸化情况,应用 Western blotting 测定了 p38、p-p38、ERK1/2、p-ERKl/2、JNK、p-JNK 等蛋白表达水平。结果表明,联合使用SeMet和NAC能显著降低由AFB1和OTA诱导的ERK MAPK通路蛋白的激活。通过使用ERKl/2、p-38和JNK的激活剂证明,SeMet和NAC的联合保护作用是通过ERKMAPK信号通路来实现的,而与p-38和JNK信号通路无关。综上所述,SeMet与NAC联用可减轻猪肺泡巨噬细胞中AFB1和OTA诱导的联合免疫毒性和氧化应激,且与ERK MAPK途径有关。