类黄酮和α-淀粉酶相互作用特性及机理的研究

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类黄酮是自然界中广泛存在的一大类多酚化合物,其具有抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防心血管疾病、抗癌等生物活性,故而引发了对生物类黄酮在食品、医药工业领域的广泛研究、开发和利用。类黄酮分子中含有多个活性酚羟基,被人体摄入后,其可能与唾液淀粉酶、胰腺-淀粉酶等消化道酶发生相互作用,进而影响酶蛋白的催化活性及类黄酮的抗氧化活性。因此,本文选取了六种在结构上具有一定代表性的类黄酮(木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素),研究了这六种类黄酮与猪胰腺α-淀粉酶(pig pancreatic α-amylase, PPA)相互作用特性的变化,以及初步探讨了两者间发生相互结合作用的主要作用力及其构效关系。在研究六种类黄酮对PPA催化活性影响的过程中,得出六种类黄酮(木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素)对PPA的催化活性均有一定程度的抑制作用。当类黄酮质量浓度为1mg/mL时,木犀草素对PPA(0.616U/mL)催化活性的抑制作用最大,抑制率达到81.24%;槲皮素对PPA催化活性的抑制作用最小,抑制率仅为9.82%,六种类黄酮对PPA催化活性的抑制率大小顺序为,木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。通过酶动力学研究表明,这六种类黄酮对PPA的抑制作用类型均属于非竞争性抑制。六种类黄酮对PPA的荧光特性均存在不同程度的猝灭作用。随着类黄酮浓度的逐渐增大,PPA的内源荧光强度呈规律性降低,其荧光猝灭常数均大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数2×1010L/(mol·s),因此其荧光猝灭类型均属于静态猝灭。分析显示,六种类黄酮和PPA相互作用均只有一个结合位点,且作用力较强。同时,根据结合常数的大小,其结合作用的强弱顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。热力学研究结果显示,六种类黄酮和PPA间的相互作用力类型均以疏水作用力为主。研究了PPA对六种类黄酮的抗氧化活性的影响。PPA对类黄酮ORAC抗氧化体系、清除DDPH自由基以及还原能力的抑制作用均不明显,最大抑制率分别为19.88%、18.91%、17.04%。但PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用程度较大,最大抑制率为44.21%。PPA对这六种类黄酮抗氧化活性的抑制作用强弱顺序均为:木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。对不同结构类黄酮与PPA结合作用的构效关系进行了分析。类黄酮分子中羟基基团的总数、B环上的羟基基团对类黄酮与α-淀粉酶的结合作用无明显影响;C环上C-3位的羟基基团,不利于类黄酮与α-淀粉酶的结合作用; B环上羟基基团的甲基化,能削弱其与α-淀粉酶的结合作用强度。
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