癌症治疗中出现的一大难题是患者肿瘤组织对药物形成的耐药性。肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance，MDR）是导致化疗失败、限制治愈率和降低肿瘤患者生存率的主要原因之一。近年来研究显示，p53可能在癌细胞多药耐药发生发展中发挥一定作用，但p53基因状态与MDR机制是多途径、多因素参与的复杂的生物学过程，因此，阐明二者之间的联系，对指导临床肿瘤药物治疗、提高治愈率均有重要意义。多项研究显示，细胞凋亡并不是p53介导MDR细胞死亡的唯一途径，另一种程序性死亡即自噬性死亡有可能参与这一程序的调控。自噬是细胞在营养物质缺乏、毒性压力等条件下蛋白质动态降解的过程，自噬性细胞死亡是不同于细胞凋亡的另一种细胞程序性死亡模式，被称之为Ⅱ型程序性细胞死亡。目前研究发现，自噬在多种肿瘤细胞中被激活或被抑制，并对肿瘤细胞的存活及对化疗药物的耐药性产生重大影响。值得注意的是，p53在自噬的调节过程中起到双重角色。目前认为，调控p53产生的自噬在细胞中的作用可能依赖于p53在细胞内的定位。细胞核内的p53诱导自噬，促进细胞死亡；而细胞质的p53抑制自噬，这种自噬抑制为肿瘤生长提供了两种生长优势：一方面抑制了凋亡，另一方面使肿瘤细胞在营养缺乏的情况下通过自噬促进细胞生存。目的：本研究利用不同p53基因表达背景的人卵巢癌SKOV3/SKVCR细胞系和人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CEM/CEM-VLB细胞系，通过转染wt p53或p53-175H，检测外源获得性p53与内源性突变p53对细胞耐药性的影响，并深入探讨wt p53和p53-175H逆转肿瘤细胞化疗耐药的机制；明确p53在细胞内不同的定位对自噬调控的作用。方法：⑴Western blot检测蛋白水平变化；⑵应用qRT-PCR方法检测细胞内mRNA水平变化；⑶CCK-8(Cell counting Kit-8)法检测细胞增殖活性；⑷MDC染色法检测自噬发生率；⑸Hoechst33342/PI双染色法检测细胞凋亡和坏死；⑹流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡；⑺应用X线深部治疗机对细胞进行照射；⑻应用Stutent’s t-test对数据进行统计分析，p<0.05被认为有统计学差异。结果：(1)自噬在肿瘤细胞化疗耐药中的作用在本研究中，经qRT-PCR和Western blot检测显示，耐药SKVCR细胞的MAPLC3Ⅱ和Beclin1基因与蛋白表达水平均高于药敏SKOV3。SKVCR细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值高于SKOV31.68倍，以上说明SKVCR细胞基础自噬水平高于SKOV3细胞。为了明确这种高水平自噬是否会影响细胞药物敏感性，我们在应用化疗药物之前先给予SKVCR细胞2mM3-MA作用1h,检测结果显示SKVCR细胞增殖活性明显降低，对长春新碱药物敏感性明显增加。这表明抑制自噬可增加SKVCR细胞化疗敏感性。截然相反的是，在人白血病耐药细胞CEM-VLB中检测发现，自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ表达水平低于CEM细胞，说明CEM-VLB本底自噬水平较低。我们分析，这可能是由于两种细胞p53状态的不同，导致自噬表现不同。(2)外源获得性p53可逆转SKVCR细胞化疗耐药本研究中，SKOV3/SKVCR为p53功能缺失的细胞系，我们通过转染wt p53和p53-175H发现，0.2μg/mLVCR组，与对照相比，SKVCR-wtp53和SKVCR-175H的增殖活性分别降至64.51%和43.95%（P<0.05）；0.5μg/mLTHP组，SKVCR-wtp53和SKVCR-175H的增殖活性分别降至40.81%和33.06%（P<0.05）。这些结果说明，无论是wt p53还是175H的导入，都增加SKVCR对化疗药物敏感性，可以逆转SKVCR化疗耐药。(3) wt p53和175H在细胞死亡中发挥不同作用本研究通过检测细胞凋亡、自噬及坏死，分析了wt p53和175H触发细胞死亡的不同机制。我们以VCR药物为例，选择两个药物剂量点（0.02和0.2μg/mL），作用于细胞48h后，采用Western blot、MDC染色和Hoechst33342/PI双荧光染色检测分析显示，在药物VCR作用下，wt p53下调LC3Ⅱ，降低自噬发生率。与此相反的是，SKVCR-175H细胞随着VCR剂量增大，其LC3Ⅱ量累积增加，细胞维持在高自噬水平。在药物VCR压力下，SKVCR-wtp53和SKVCR-175H的凋亡率均增高。蛋白检测分析显示，在低剂量VCR作用时，DNA发生损害，wt p53和p53-175H均被激活，促进p21表达。以上结果说明，wt p53的导入使SKVCR的化疗敏感性增加，主要通过降低自噬和促进细胞凋亡，导致细胞死亡；而175H使细胞药敏性增加，可能通过自噬积累、促进凋亡及坏死三种途径。(4)药物VLB对CEM、CEM-VLB细胞自噬的影响本实验中，我们采用IC50值作为等效药物剂量点，探讨在相同压力条件下亲本及耐药细胞的p53与自噬调控的机制。CEM经0.01μg/mLVLB、CEM-VLB经0.5μg/mL VLB作用后，提取0、4、8、16、24h时间点的细胞总蛋白。蛋白检测显示，在CEM细胞中，0.01μg/mLVLB刺激作用激活了p53蛋白表达，LC3发生了LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，8h达到峰值，之后，LC3Ⅱ随p53表达量减弱而降低。MDC荧光染色检测得到同样的结果，0.01μg/mLVLB刺激CEM细胞可明显增强其自噬水平。但是CEM-VLB似乎对药物的刺激作用并未产生任何生物学效应。细胞周期检测显示，CEM+0.01μg/mL VLB组的S期和G2/M期阻滞最为明显，这可能与CEM细胞内p53基因状态有关。(5)电离辐射对CEM、CEM-VLB细胞p53通路及自噬的调控本研究发现，6.0Gy X射线照射诱导CEM、CEM-VLB细胞的p53蛋白持续高表达。在CEM细胞中，电离辐射诱导p53激活其下游基因p21持续表达，而CEM-VLB细胞激活p53未见p21阳性条带。此外，电离辐射不同程度诱导了CEM、CEM-VLB的自噬发生，对CEM细胞诱导自噬作用更明显。进一步采用MDC荧光染色检测自噬发现，电离辐射作用后，MDC阳性细胞百分数CEM细胞由25.24%升高至74.41%，CEM-VLB由23.19%上升至54.03%。蛋白检测显示，IR联合3-MA作用，下调CEM、CEM-VLB细胞LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，抑制自噬的发生。在CEM细胞中， IR联合3-MA组，p53异常条带消失，并伴有p21表达减弱。结果说明，p53是自噬的调节中的一个重要角色。(6)电离辐射对CEM、CEM-VLB细胞自噬及凋亡的调控2mM3-MA作用1h，联合6.0Gy X线照射16h后，收集细胞，通过AnnexinV/PI双荧光染色检测显示，单独6.0Gy X线照射使CEM、CEM-VLB细胞凋亡发生率分别增加至22.03%和12.11%（P<0.05）。IR联合3-MA组，可有效地诱导CEM和CEM-VLB细胞发生凋亡，且联合治疗组的作用明显优于单纯照射组。结论：⑴自噬在人卵巢癌细胞（SKOV3）和人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞（CEM）中对多药耐药的调控作用不同。在SKOV3/SKVCR细胞中，耐药细胞SKVCR自噬水平高于药敏细胞SKOV3，抑制自噬可有效增加SKVCR的化疗药物敏感性。在CEM/CEM-VLB细胞中，药敏细胞CEM自噬水平高于耐药细胞CEM-VLB。⑵外源获得性wt p53和p53-175H，可有效增加SKVCR细胞的化疗敏感性，逆转多药耐药。⑶wt p53和p53-175H在细胞死亡中发挥着不同调控作用。外源获得性wtp53主要通过抑制SKVCR细胞自噬，同时促进细胞凋亡的发生；175H主要引起自噬积累、增加细胞凋亡和坏死，促进细胞死亡。⑷药物VLB刺激CEM细胞内源性p53（175/248）上调，从而激活自噬。等药效剂量VLB不能刺激CEM-VLB细胞发生自噬。⑸在CEM细胞中，6.0Gy X线电离辐射激活内源性p53（175/248），诱导细胞自噬；而抑制自噬，内源性p53（175/248）蛋白对p21激活作用减弱。⑹自噬抑制联合X线照射，可有效地诱导CEM和CEM-VLB细胞发生凋亡，且联合治疗组的作用明显优于单纯照射组。综上所述，本研究证实外源获得性wt p53可抑制卵巢癌细胞自噬，逆转肿瘤细胞耐药，同时促进细胞凋亡；内源性p53（175/248）可被药物或电离辐射诱导而激活，促进自噬；电离辐射联合自噬抑制可有效增加白血病细胞凋亡率。本研究认为p53是参与自噬调控的重要因子，这一机制的阐明，将为卵巢癌和急性淋巴细胞白血病临床治疗的潜在作用靶点提供依据，为寻找逆转耐药的新的抗癌疗法的产生奠定了基础。