目的:目前精原干细胞体外培养体系存在缺陷,本课题的研究目的是进一步拓展优化精原干细胞的体外培养体系。由于组织特异性的细胞外基质水凝胶具有特殊的结构和生物活性物质,可调控细胞的增殖分化行为,本课题拟采用睾丸组织来源的脱细胞基质(DTM)水凝胶来研究其对精原干细胞增殖分化的影响,建立基于DTM水凝胶的精原干细胞体外增殖分化培养体系,用于精原干细胞体外增殖分化机制研究。方法:首先,利用化学脱细胞剂与胃蛋白酶溶解法制备睾丸脱细胞基质水凝胶,通过一系列的表征实验优化脱细胞条件以及水凝胶制备条件。然后通过活死细胞染色、碱性磷酸酶染色、RT-PCR、流式分析、BSP测序等方法比较层粘连蛋白(Laminin)、商业化基质胶(Matrigel)、睾丸脱细胞基质(DTM)水凝胶三种培养体系对精原干细胞增殖及干性维持的影响。最后,研究该培养体系对精原干细胞的体外诱导分化的影响,通过RT-qPCR、免疫荧光、流式分析探索DTM水凝胶在体外促进精原干细胞分化成精子的可行性。结果:实验结果表明,冻融与1%SDS处理18h相结合可有效去除睾丸组织的细胞成分,并保留睾丸组织的微细结构及生物活性物质。通过5个步骤:冻干、剪碎、酶解、离心、聚合,我们成功将睾丸外基质制作成水凝胶材料,其中2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL溶液浓度均能成功聚合形成胶状。DTM水凝胶在体内外具有良好的生物相容性,在体外重构的微环境中能促进精原干细胞的增殖与提高精原干细胞的活性,DTM水凝胶能维持精原干细胞的干性及功能。此外,DTM水凝胶的3D培养体系与层粘连蛋白及商业化基质胶培养体系相比,可显著促进精原干细胞分化为单倍体圆形精子。结论:睾丸脱细胞基质在胃蛋白酶作用下通过改变酸碱度和磷酸盐能自组装成有生物活性的DTM水凝胶,DTM水凝胶对精原干细胞的增殖与分化具有促进作用。