研究背景和目的宫颈癌是一种女性常见的妇科恶性肿瘤,它由人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)引起。宫颈癌最常见的症状是阴道异常出血,但可能在某些情况下没有明显的症状,直至宫颈癌晚期才出现。早期宫颈癌治疗通常包括手术(包括局部切除),晚期可加化疗和/或放疗。光动力疗法(PDT)已被证实是治疗宫颈癌的一种有前景的方法。所谓PDT疗法,是指光敏剂通过定位在肿瘤组织上,用特定波长的激光照射后产生单线态氧与其他活性氧成分,因此造成该部位的肿瘤细胞与组织产生光损伤。和医学上常规的手术、化疗等方法相比,光动力治疗具有毒性小,创伤小,选择性、适用性以及重复性好,它可以姑息治疗以及消灭隐性病灶,还能够保护容貌和人体重要器官等,国内外已经开始应用于各种癌症的治疗,并逐渐成为一种新的治疗癌症的方式。如果在治疗中选择了最佳的光动力参数,早期宫颈癌可以得到彻底治愈,而晚期宫颈癌也能获得比较好的疗效。但是在临床工作中,光动力治疗宫颈癌的最佳参数还没有确定,所以其疗效还是不稳定。光动力治疗损伤癌细胞的方式主要是凋亡和坏死两种方式,但究竟以哪种方式为主则主要取决于癌细胞的类型,激光功率密度,光敏剂的浓度与其亚细胞定位等等。研究表明,定位于线粒体的光敏剂,比如5-氨基乙酰丙酸及其甲酯(MAL),能导致癌细胞以凋亡为主的死亡方式,同时导致其相关的凋亡基因和蛋白的表达发生改变。前人的研究表明,可以通过上调或下调其表达来加强PDT效应。但其在MAL-光动力治疗肿瘤中的作用机制仍然不明确。MAL是第二代光敏剂,美国FDA已于数年前批准它用于临床实验治疗。MAL是一种内源性光敏剂,它是活细胞血红素的前体物件,它在PDT治疗中可产生发挥光敏剂作用的原卟啉-Ⅸ。该光敏剂与photofrin相比,其光毒性远远短于photofrin,大约24小时。另外,MAL的脂溶性比ALA更强,更容易进入细胞内。本课题第一部分介绍激光医学与光动力疗法；第二部分通过研究MAL-PDT在宫颈癌的体外效应探讨其最佳作用参数,为临床光动力治疗参数的选择提供一定依据,并探讨光动力剂量杀伤宫颈癌Hela细胞的主要作用机制；第三部分用蒙特卡罗方法建立宫颈癌光动力治疗的物理模型。方法1.MAL孵育时间对其介导PDT的影响：使用相同浓度的MAL孵育不同时间的宫颈癌Hela细胞,用相同光功率密度的激光照射,用MTT法来测定细胞存活率。2.MAL浓度对其介导PDT的影响：使用不同浓度的MAL孵育相同时间的Hela人宫颈癌细胞,用相同光功率密度的激光照射,用MTT法来测定细胞存活率。3.光功率密度对MAL介导PDT的影响：使用相同浓度的MAL孵育相同时间的宫颈癌Hela细胞,用不同光功率密度的激光照射,用MTT法来测定细胞存活率。4.MAL本身对Hela细胞的影响：使用不同浓度的MAL孵育相同时间的宫颈癌Hela细胞,不给予激光照射,用MTT法来测定其细胞存活率。5.单激光照射对Hela细胞的影响：不给予MAL,培养相同时间的宫颈癌Hela细胞,用不同光功率密度的激光照射后,用MTT法来测定其细胞存活率。6.光镜下观察MAL-PDT前后宫颈癌Hela细胞形态学的改变。7.建立宫颈癌组织光动力治疗的物理模型,用蒙特卡罗方法模拟宫颈癌组织中光的分布。8.建立光动力剂量与光敏剂浓度、光功率密度、光漂白速率、氧浓度之间的函数关系。结果1.检测在相同的情况下,MAL培养时间分别为1、3、6、8、12小时的宫颈癌Hela细胞存活率。MAL培养时间不同,各组细胞存活率明显不同,在MAL孵育时间为6小时之前,宫颈癌Hela细胞存活率随着培养时间的增加而降低,而培养时间超过6小时后则Hela细胞存活率与培养6小时相比没有显著变化。2.在相同的光功率密度下,MAL的浓度为0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、 0.4、0.8、1.6mmol/L的Hela细胞存活率逐渐降低。MAL的浓度由0.00625mmol/L上升至0.05mmol/L区间,其细胞存活率降低得很厉害；而∥0.05mmol/L上升至1.6mmol/L区间,细胞存活率降低得却不是很明显。3.给予相同的MAL浓度,当光功率密度分别为3、6、9、18、27J/cm2时宫颈癌Hela细胞存活率分别逐渐降低。由此可见宫颈癌细胞Hela的存活率随着光功率密度的加大而降低,表现出显著性负相关。4.不使用激光照射时,MAL的浓度分别为0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mmol/L的细胞存活率都在99%以上。各组之间的细胞存活率均没有显著性差异。5.不给予MAL培养,单用激光照射,光功率密度为3、6、9、18、27J/cm2时的细胞存活率都在99%以上,各组之间的细胞存活率均没有显著性差异。6.MAL-光动力作用后,凋亡早期的宫颈癌Hela细胞间失去了彼此连接,并收缩呈圆形,其轮廓更清晰可见,细胞附壁能力降低,容易从培养板上脱落,但细胞膜仍保持完整。凋亡后期细胞体积缩小并变形、出现皱缩,染色质浓缩边集,并形成凋亡小体。对照组细胞生长良好,没有出现该现象。7.利用蒙特卡罗方法建立了比较接近实际的宫颈癌组织的物理模型,并对其中的光传输过程,光漂白规律,光敏剂的分布规律,以及氧扩散过程进行了理论探讨和分析。8.利用该模型建立了宫颈癌组织中光动力剂量与光敏剂浓度、光功率密度、光漂白和氧浓度之间的函数关系,并利用这些函数探讨了宫颈癌组织中光动力剂量的分布与上面几个因素之间的关系,阐述了氧对MAL-PDT过程中最佳光动力剂量的影响。结论1.MAL-PDT对人宫颈癌细胞Hela细胞有明显的增殖抑制作用。在一定激光光源条件下,光敏剂培养时间、培养浓度及光功率密度是Hela细胞体外光动力效应的主要影响因素。在特定培养时间下(培养时间为6h),当培养浓度为0.05mmol/L,光功率密度为18J/m2时其杀伤效应最强。而当培养浓度由0.05mmol/L增加到1.6mmol/L时,光功率密度由18J/cm2增至27 J/cm2时杀伤效应到达平台期。特定光功率密度下(光功率密度为18J/cm2),当培养浓度为0.05mmol/L,培养时间为6小时其杀伤效应最强。而当培养浓度由0.05mmol/L增加到1.6mmol/L时,培养时间由6小时增至12小时其杀伤效应亦到达平台期。2.光敏剂、光和氧在宫颈组织内部呈现出非均匀分布,首先氧和MAL在各处的分布密度与其距血管的距离相关,与血管距离越近其分布密度越大,同时还与光漂白速率相关,光漂白速率越大之处,光敏剂浓度就越小。宫颈癌组织周围由于存在丰富的血管组织,因此氧和MAL集中分布在宫颈癌组织中。3.光动力剂量与宫颈组织中MAL浓度、光功率密度和氧浓度等因素相关。在氧充足的地方,光动力剂量与光功率密度和MAL浓度的乘积正相关,在氧不充分的地方,光动力剂量与MAL浓度、光功率密度和氧浓度之间呈现出复杂的非线性关系。