毛裂蜂斗菜（Petasites tricholobus Franch.）是菊科蜂斗菜属植物，广泛分布于西南、西北地区，其根茎民间用于解毒祛瘀，外敷治跌打损伤、骨折蛇伤等，其花蕾在中国西北地区作为款冬花的替代品用于止咳、平喘。研究背景:蜂斗菜属植物欧蜂斗菜（Petasites hybridus）作为植物药，在欧洲已经有几百年的应用历史。其根茎的二氧化碳提取物用于治疗偏头疼,泌尿生殖道痉挛,哮喘，过敏性鼻炎等。倍半萜类化合物被认为是其主要有效成分，现代药理研究表明，蜂斗菜素（petasin）和硫蜂斗菜素（S-petasin）等倍半萜类化合物具有抗炎，抗组胺，抗氧化，抑制白三烯合成，降低细胞内钙离子浓度的作用，从而达到抗炎、解痉的药效。倍半萜内酯类化合物，初步的体外药理实验表明，这类化合物有具较强的抗氧化活性，抗炎作用，可减轻神经毒性，具神经细胞保护作用。为了开发我国蜂斗菜属植物资源，本课题组在前期对其同属植物毛裂蜂斗菜（Petasites tricholobus Franch.）的化学成分进行了较为系统性的研究，从毛裂蜂斗菜根茎中分离得到倍半萜内酯类化合物蜂斗菜内酯D、蜂斗菜内酯B以及蜂斗菜内酯Ⅰa，蜂斗菜内酯Ⅱa，蜂斗菜内酯Ⅲa，蜂斗菜内酯Ⅳa，蜂斗菜内酯Ⅴa5个倍半萜类新化合物。本论文作为延续性工作，着重对毛裂蜂斗菜内酯类有效成分的制备工艺及抗脑缺血的药效学进行研究，旨在为毛裂蜂斗菜资源的开发利用以及毛裂蜂斗菜总内酯的新药研发奠定基础。研究目的：通过对毛裂蜂斗菜中蜂斗菜总内酯（PTZNZ）的制备工艺及抗脑缺血的药效学研究，明确其药理活性，并对其药效机理进行深入的探讨，为毛裂蜂斗菜的开发利用以及新药的研发奠定基础。研究方法和结果：1、采用HPLC方法，建立毛裂蜂斗菜根茎的内酯类有效成分的含量测定方法并对并对毛裂蜂斗菜根茎的内酯类有效部位进行制备工艺研究，确定了最佳工艺路线。本工艺总内酯在纯化过程的平均转移率为89.3%，产品平均纯度为65.9%。2、蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ对缺氧-复氧致PC12细胞损伤的保护作用研究。采用缺氧-复氧致PC12细胞损伤的细胞模型来筛选蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、蜂斗菜总内酯的生物活性。通过检测蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ预处理后对PC12细胞缺氧-复氧损伤后的细胞存活率和乳酸脱氢酶的量来观察其对PC12细胞的保护作用。采用MTT法检测蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ分别为15.6ng/ml、31.25ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml时对PC12细胞存活率的影响，结果显示，这一系列浓度均能提高PC12细胞存活率，且效应呈现剂量依赖性，故确定其最大剂量为2000ng/ml。缺氧预处理可以使PCI2细胞存活率下降至（35.6±4.8）%；蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ分别为最大浓度2000ng/ml时，可以使细胞存活率分别由（35.6±4.8）%依次上升至（63.4±7.7）%、（68.1±1.4）%、（73.3±1.3）%、（75.3±0.7）%、（70.4±1.5）%。另外，检测了蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ浓度分别为20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml时对PC12缺氧-复氧损伤后释放乳酸脱氢酶的影响。结果显示，模型组与正常组比较，缺氧处理后细胞上清液中LDH含量由391±14.5（U/L）升高到1319.8±48.6（U/L）（P＜0.01）；蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ为20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml时能降低细胞上清液中LDH含量，且效应呈现剂量依赖性。蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ为最大浓度2000ng/ml时可以使细胞上清液中LDH含量分别由1319.8±48.6（U/L）降低至778±21.8（U/L）、674.7±23.3（U/L）、558.8±11.7（U/L）、520±15.2（U/L）、586.5±35.3（U/L）（P＜0.01）。综上所述，蜂斗菜内酯-D、B、Ⅳa、Ⅲa、PTZNZ均能提高缺氧-复氧损伤后PC12细胞存活率，抑制其乳酸脱氢酶的释放，保护神经元细胞。3、PTZNZ对线栓法致大鼠局灶性脑缺血的治疗作用。建立线栓法致大鼠局灶性脑缺血的动物模型来观察蜂斗菜总内酯对脑缺血的保护作用。结果显示：大鼠在手术后都有非常明显的行为学缺陷和大脑组织坏死。PTZNZ5mg/kg对大鼠行为学评分及脑坏死百分率有降低作用，但仅脑坏死百分率与模型组比较有显著差（P<0.05）；PTZNZ10mg/kg和20mg/kg对大鼠行为学评分和脑坏死百分率都有显著的降低作用（P<0.01，与模型组比较）。阳性药银杏叶片、依达拉奉也能有效改善大鼠的行为学缺陷、降低脑坏死百分率（P<0.05，与模型组比较）。与阳性药银杏叶片、依达拉奉比较，PTZNZ各剂量（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）组对大鼠行为学及脑坏死百分率均无显著性差异（P>0.05）。故PTZNZ5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg对线栓法引起的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显的治疗作用，能改善行为学缺陷，降低脑坏死百分率。4、PTZNZ对缺氧-复氧致大鼠海马神经元细胞损伤的保护作用。采用原代大鼠海马神经元细胞缺氧-复氧模型，模拟缺血-再灌注对细胞造成的损伤，通过采用Hoechst-PI染色法、Tunel法和蛋白质印迹法检测细胞存活率、凋亡率和凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达来观察蜂斗菜总内酯对缺氧-复氧致大鼠海马神经元细胞损伤的保护作用。结果显示，模型组与正常组比较，缺氧处理后细胞存活率下降至50.4%（P0.05），细胞调亡率上升至53.6%（P0.01）；蜂斗菜总内酯最大剂量给药组（2000ng/ml）与模型组比较，给药组的细胞存活率上升至79.4%（P0.01），细胞调亡率降低至30.3%（P0.05）。另外，正常对照组与模型对照组比较，模型组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达水平上升，两组间差异均有统计学意义（P0.01）；PTZNZ各个剂量给药组（20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml）与模型组比较，给药组的细胞Bax蛋白表达水平下降，Bcl-2蛋白表达水平上升。给药各个剂量组与模型组间的差异均有统计学意义（P0.05），并且有一定的量效关系。表明蜂斗菜总内酯各个剂量组（20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml）能不同程度地保护原代大鼠海马神经元形态，提高细胞增殖率，降低细胞凋亡率，并能下调促调亡蛋白Bax和上调抑调亡蛋白Bcl-2，降低缺氧引起的细胞调亡率，达到保护神经元作用。5、PTZNZ对缺氧-复氧致大鼠海马神经元细胞损伤的保护作用机制探索。采用免疫荧光法和蛋白印迹法检测NF-κB信号通路中P65、P-P65、P-IκB、IκB、IκK、P-IκK蛋白表达水平及NF-κB相关通路Akt和ERK中AKT、P-AKT、ERK、P-ERK的蛋白表达水平来观察PTZNZ对神经元细胞的保护作用机制。实验结果显示：缺氧处理后能上调NF-κB信号通路中P65、P-P65、P-IκB、IκK、P-IκK蛋白的表达，下调IκB蛋白的表达，并能激活NF-κB通路的核转录；PTZNZ各剂量组（20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml）能下调P65、P-P65、P-IκB、IκK、P-IκK蛋白的表达，上调IκB蛋白的表达，并能抑制NF-κB通路的核转录。表明缺氧处理能激活NF-κB通路，PTZNZ（20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml）通过抑制NF-κB通路的激活，达到保护神经元细胞作用，且有一定的量效关系。另外，模型组与正常组比较，NF-κB相关通路Akt和ERK中AKT、P-AKT、ERK、P-ERK的蛋白表达水平上升；PTZNZ各剂量组（20ng/ml、200ng/ml、2000ng/ml）能下调AKT、P-AKT、ERK、P-ERK蛋白的表达，且呈量效关系。表明缺氧处理能激活NF-κB通路及其相关通路Akt和ERK，PTZNZ通过抑制其激活，保护海马神经元细胞。6、PTZNZ初步急性毒性实验结果表明，PTZNZ小鼠灌胃给药的无毒剂量为4.0g/Kg（相当与大鼠有效剂量的400倍），半数致死量LD50值为6.9g/kg。结论：通过蜂斗菜总内酯制备工艺得到的PTZNZ，其总内酯含量为65.9%，平均转移率为89.3%。本工艺适用于从提取液中纯化PTZNZ，具有稳定、快速、成品得率高及转移率高的优点。PTZNZ对线栓法引起的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显的治疗作用，并对缺氧-复氧致神经元细胞损伤有一定保护作用，其作用机制与NF-κB通路有关。