机体在病毒感染中的免疫反应机制是免疫研究的热点。病毒感染机体后，存在着机体如何抵抗病毒的侵袭、病毒又如何逃逸免疫反应的斗争过程，认识和掌握该机制对于病毒感染意义重大。在病毒感染过程中，免疫细胞可以通过模式识别受体识别病毒成分，进而活化下游信号途径，表达Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)和促炎症细胞因子，进而发挥重要的抗病毒作用。I型干扰素作为一类重要的细胞因子，有着广泛的生理活性，参与抗感染、抗肿瘤以及免疫调节作用，并在抗病毒免疫中发挥特别重要的作用；另一方面，病毒也常常作用于I型干扰素信号途径，实现免疫逃逸，促进自身在体内的表达。目前，I型干扰素已经广泛应用于临床疾病的免疫治疗中，然而根据流行病学分析发现，I型干扰素在不同类型的病毒感染治疗中效果差异很大，但导致I型干扰素治疗不同类型的病毒感染效果差异的机制仍然不清楚，因此，深入研究与认识干扰素的表达及其下游信号的调控机制，具有重要的科学意义。Micro-RNAs(miRNA)对免疫细胞的调控机制是近年来免疫学研究的热点。miRNA是细胞内一类表达丰富、非编码的高度保守的RNA片段,长度一般为18-25nt。miRNAs表现出一种转录后调控基因表达的全新机制,它通过结合靶基因的mRNA的3’UTR区域抑制基因的表达。目前miRNA的研究已成为生命科学研究领域的一个热点，但目前仍然只有一小部分miRNA生物学功能得到阐明，这些miRNA调节细胞生长、组织分化，因而与生命过程中发育、疾病高度有关,并在炎症反应和肿瘤的发生等多种生理与病理过程中发挥作用。我们通过高通量miRNA芯片筛选，发现在VSV(vesicular stomatitis virus)感染小鼠腹腔巨噬细胞的过程中，胞内miR-93的表达显著降低，我们对miR-93的生物学功能及其作用机制进行了研究，发现miR-93具有调控干扰素信号通路并影响病毒感染的作用。第一部分：RNA病毒感染通过RIG-I/JNK途径诱导巨噬细胞下调表达miR-93首先我们通过RT-PCR实验证实了RNA病毒感染后miR-93的下调，并研究了RNA病毒感染后miR-93发生下调的机制。实验发现在VSV或SeV病毒感染后，miR-93在巨噬细胞中会出现下调表达；分析临床流感感染患者的样本miR-93的表达发现：在甲型流感病毒感染的病人的PBMC中，miR-93也发生了下调，提示病毒感染后miR-93的改变具有临床病理意义。研究病毒感染后miR-93表达改变的机理，分别采用TLR3、TLR4、TLR9或Myd88缺陷的小鼠腹腔巨噬细胞，发现VSV感染后miR-93的表达下调趋势没有改变，从而排除TLR信号对于miR-93表达的影响；而用RIG-I缺陷的小鼠巨噬细胞，病毒感染后未出现miR-93表达的下调，由此可推断巨噬细胞感染病毒miR-93的下调是RIG-I依赖的。作为对照，LPS诱导的miR-93的表达下调在RIG-I缺陷的巨噬细胞中没有影响，而LPS诱导后miR-93的下调在TLR4缺陷的腹腔巨噬细胞中被阻断。进一步采用PRR信号通路抑制剂，我们发现巨噬细胞感染VSV后miR-93表达的下调依赖于JNK通路；采用ChIP研究miR-93启动子区，发现miR-93的下调与其启动子区组蛋白的H3K4位点的甲基化和H3K27的去甲基化有关。第二部分：VSV感染后机体通过下调表达miR-93增强I型干扰素的下游信号从而抑制病毒复制为了探讨RNA病毒感染后miR-93下调的生物学意义，我们分析了巨噬细胞表达的miR-93对VSV复制的影响。结果发现高表达miR-93可增强VSV在细胞中的复制，显著增加细胞培养上清中的病毒量。为了探究miR-93病毒与病毒复制相互作用的分子机制，我们首先观察了miR-93的上调表达是否会影响到I型干扰素本身的产量。mRNA和蛋白水平的结果都显示，miR-93mimics与inhibitor对于VSV诱导的IFN-β、TNF-α、Il-6等细胞因子的产量不发生影响，同时IRF3、NF-κB、P38、ERK、JNK等的磷酸化程度也没有发生变化。于是我们将研究点着重于分析I型干扰素下游信号的变化。已有的研究结果显示VSV病毒感染会引起STAT1分子的磷酸化，并在24小时候达到最高峰。Western结果显示miR-93高表达后STAT1的磷酸化水平被抑制。使用IFN-β刺激高表达miR-93的巨噬细胞，发现I型干扰素途径的下游基因ISG15和IP10的表达也被抑制。以上结果提示，miR-93是通过抑制了I型干扰素途径的下游信号发挥了促进病毒复制作用，对于干扰素本身的产量没有影响。第三部分：miR-93通过靶向JAK1蛋白调控I型干扰素的信号传递过程接下来我们探讨了miR-93作用于哪个靶分子发挥了抑制JAK/STAT通路及其下游信号的作用。通过TargetScan(www.targetscan.org)在线软件，我们发现miR-93在JAK1的3’UTR区域的861-867与1085-1091区域存在保守的靶位点。而JAK1蛋白是JAK/STAT信号转导途径中的关键信号分子，所以我们推测，在VSV刺激巨噬细胞后的miR-93的下调是促进了JAK1蛋白的翻译。于是我们通过RT-PCR和Western Blot实验证实了miR-93在巨噬细胞中高表达后，JAK1蛋白的mRNA与蛋白水平均发生下降。而双荧光报告的结果也证明了miR-93可以靶向JAK1的3’UTR区域发挥作用。为了进一步证明miR-93对于I型干扰素通路的作用靶点是JAK1，我们采用JAK1siRNA和JAK1高表达实验，结果发现JAK1的干扰RNA可以起到和高表达miR-93相似的作用，即促进VSV病毒的复制。而miR-93inhibitor对于IFN-β诱导的ISG15的上调表达也能被JAK1的siRNA所阻断。通过构建高表达JAK1(不含3’UTR)的RAW264.7稳转细胞系，在VSV刺激后，miR-93无法调控JAK/STAT通路及其下游而发挥抗病毒作用，进一步证实miR-93靶向作用JAK1来调控I型干扰素通路从而影响病毒的复制。第四部分：病毒感染后机体表达miR-93调控JAK/STAT通路及其体内的效应研究为了进一步验证miR-93的体内效应，我们合成了胆固醇修饰的miR-93体内运载试剂Agomir-93(广州市锐博生物科技)，并通过尾静脉注射使小鼠体内高表达miR-93。实验结果发现，小鼠体内高表达miR-93后感染VSV病毒，可显著降低肝、肺、脾中的JAK1蛋白表达；肺部组织切片分析显示，miR-93高表达后肺中的有核细胞数显著增加，肺泡结构不清，损伤加重；而肝脏和脾脏中的病毒负荷明显提高；但血清中IFN-β的量与对照组相比没有变化。以上体内试验反证说明机体感染病毒后可通过上述机制下调miR-93表达从而增强I型干扰素下游信号发挥抗病毒效应。综上所述，生物体遭受RNA病毒感染后，机体可适应性降低miR-93的表达，反馈增强I型干扰素下游信号发挥抗病毒作用，成为机体发挥抗病毒作用的新机制。