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背景PTEN是在许多类型的人类恶性肿瘤中,经常发生突变、缺失和转录沉默的抑癌基因。作为经典的PI3K/Akt促细胞生长信号通路的负调控因子,PTEN通过其脂质磷酸酶活性,将磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)去磷酸化为磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2),从而抑制了细胞存活、增殖和血管生成。另外,PTEN通过其蛋白磷酸酶活性能够使肿瘤细胞代谢需要的蛋白质和肽底物去磷酸化,抑制肿瘤细胞侵袭。因为PTEN蛋白上缺少典型的核定位信号(NLS),最初研究认为PTEN完全定位于细胞质。近年来,有大量研究发现在人类神经元,甲状腺组织,胰腺细胞,食管鳞状细胞癌,血管平滑肌细胞和肠粘膜中存在核PTEN的表达,但核PTEN具体能发挥什么样的生物学功能,迄今为止报道较少。蛋白质的核移位指的是真核细胞内大量的信号蛋白和分子通过核孔复合物在细胞核与细胞质之间进行交换的生物学现象,其意义在于,通过核移位机制,信号蛋白和分子可以通过对细胞核或细胞质内信号通路的调节,更有效、精细地调控细胞的增殖、凋亡、癌变等生理或病理进程,进而加速或延缓疾病的进展。中波紫外线(UVB)是太阳光中波长为280 nm-320 nm的一部分射线,大量文献表明,UVB的过量辐射能够导致表皮细胞内活性氧族(ROS)的产生,通过诱导DNA双链断裂的方式引起细胞坏死或凋亡。那么在中波紫外辐照环境下,PTEN的核、质分布会改变吗?如果发生了改变,它对细胞的生物学行为会产生什么影响?研究逆境条件下PTEN的亚细胞定位情况及其生物学功能,可以进一步揭示PTEN的核、质功能并对临床上恶性肿瘤的治疗提供理论支持。目的本实验主要探究中波紫外辐射诱导U87细胞DNA损伤前后,野生型PTEN及其单泛素化位点突变体K13E-PTEN的亚细胞定位变化情况及其对肿瘤细胞生物学行为的影响,从亚细胞定位角度,进一步探究了核PTEN的功能,为PTEN相关分子机制的深入研究奠定基础,为临床上治疗肿瘤提供新的思路。方法1.通过细胞毒性实验检测不同剂量紫外辐照和辐照后培养不同时间条件下U87细胞的活性,探究紫外对细胞的毒性作用,确定本课题适宜的紫外剂量、时间梯度。2.构建入核突变体K13E-PTEN,分别将过表达WT-PTEN、K13E-PTEN的慢病毒感染U87细胞,通过Western blot实验及其荧光共定位方法比较WT-PTEN、K13E-PTEN在U87细胞的核质分布情况。对过表达WT-PTEN和K13E-PTEN的U87细胞分别进行剂量梯度的紫外辐照,对比分析紫外线对WT-PTEN和K13E-PTEN核质分布的影响。3.分别对U87细胞、过表达WT-PTEN、K13E-PTEN的U87细胞及其空载体对照细胞,进行剂量梯度的紫外辐照,MTT法检测各类细胞的存活率,Western blot实验检测caspase-3/cleaved-caspase-3的表达情况,探讨紫外线对PTEN出入核以及对其功能的影响。结果1.紫外辐照剂量在120 mj/cm~2以内,细胞存活率较高,表明细胞对低剂量的紫外产生耐受;当紫外辐照剂量超过120 mj/cm~2后,随着紫外辐照的增强,细胞存活率逐渐降低。与对照组细胞相比,辐照组细胞随着培养时间延长,增殖活性明显受到抑制。2.过表达WT-PTEN的U87细胞核、质内均有PTEN的表达,且PTEN大量定位于细胞核;与过表达WT-PTEN的U87细胞相比,过表达K13E-PTEN的U87细胞核内几乎无PTEN的表达,PTEN几乎全部定位于细胞质。在紫外辐照条件下,K13E-PTEN与WT-PTEN在细胞核中的表达量均逐渐增强,荧光图结果显示,WT-PTEN比K13E-PTEN入核水平更高。3.与对照组相比,相同剂量紫外处理条件下,过表达WT-PTEN/K13E-PTEN的U87细胞存活率更低,凋亡更明显。与过表达K13E-PTEN的U87细胞相比,相同剂量紫外处理条件下,过表达WT-PTEN的U87细胞的存活率降低更显著,二者凋亡程度无明显差异。结论我们的研究表明,辐射可诱导PTEN及其突变体入核,其入核方式可能是主动入核,或被动弥散入核。PTEN入核后对于辐射导致的基因组损伤起协同作用,进一步促进细胞凋亡。