[目的]探讨钝挫伤所致玻璃体积血导致铁离子过载与MAPK通路机制关系。通过动态观察视网膜铁离子含量,分析HO-1,p38MAPK,ERK1/2,JNK1/2在视网膜的位置,变化、表达水平。对铁离子过载、MAPK通路、视网膜三者之间的关系以及损伤和保护机制进行探讨。为闭合性眼外伤玻血患者的治疗时机提供理论基础。[方法]成年清洁级新西兰大耳白兔40只,体重约2-2.5kg,雌雄不限,实验组分为21只,阳性对照组分为19只,不符合标准的实验兔剔除。实验组剔除3只,阳性对照组剔除1只。剔除标准如发现实验兔实验过程中出现角膜炎,角膜白斑,白内障,眼内炎等眼部疾病,或造模失败,发生死亡,将被排除实验。所有实验兔麻醉均3%戊巴比妥钠(1ml/kg)耳缘静脉注射,并右眼致伤。最终实验兔随机分为三组:(1)实验组(n=18)钝挫伤玻璃体积血组,麻醉后,侧卧于试验台,开睑器固定眼球,距离眼球1米处用约5kg钢球垂直落下,以同等质量,相同速度,相同高度击打眼球角膜中央,成批制作成重度钝挫伤玻璃体积血模型。在显微镜下观察患眼角膜水肿,瞳孔中等大,可见玻璃体完全积血,眼底窥视不清即算造模成功。(2)阳性对照组(n=18),麻醉后,平躺于手术台,开睑器固定后,复方托吡卡胺散瞳点眼,在显微镜下用1ml注射器针头视网膜上的血管挑破,形成视网膜出血,制作成非外伤性玻璃体出血。在显微镜下观察视网膜出血弥散到玻璃体,眼底部分可见或者窥视不清即算阳性对照组造模成功。(3)健康对照组(36眼),对侧眼不做任何处理,作为空白对照组。对三组兔分别进行视网膜铁离子测定,HE和普鲁士蓝染色,应用免疫组化对HO-1,p38MAPK,ERK1/2,JNK1/2 进行定位,western blot HO-1,p38MAPK,ERK1/2,JNK1/2 半定量。[结果](1)用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)来定量和比较1周、2周、4周、8周每组实验兔视网膜中的铁含量。结果表明:实验组与健康对照组相比,铁含量在1、2、4周明显增高,实验组8周轻度降低,但仍较健康对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组与健康对照组相比,铁含量1、2、4周轻度增高,在8周轻度降低,仍较健康对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组与阳性对照组相比,铁含量1、2、4周轻度增高,8周较阳性对照组轻度增高。差异有统计学意义(P<0.05)。结果与人类视网膜和大鼠视网膜的类似分析一致有显著差异[1,2]。视网膜无论是否受外伤,只要有玻璃体积血,视网膜铁含量随着时间推移,铁含量增加。但到一定时间,可能因为玻璃体积血的吸收或视网膜铁含量降低。通过对实验组,阳性对照组及健康对照组的不同时间的Fe含量比较发现4周实验组、阳性对照组的Fe含量最高,因此,HE染色、普鲁士蓝染色、免疫组化、western blot均采用三组4周的视网膜样本(2)光镜下HE染色,观察4周实验组切片发现,视网膜变薄,且结构紊乱,视锥视杆细胞层碎裂消失,内外核层明显空泡改变,细胞核数目明显减少,内外丛状层明显变薄,有的甚至消失,神经节细胞核固缩。RPE未见改变。阳性对照组较实验组视网膜改变轻。健康对照组为正常,完整视网膜参照。普鲁士蓝染色显示实验组视网膜铁沉积主要集中在神经视网膜上(内核层、外丛状层和外核层)。阳性对照组视网膜铁沉积主要集中在神经视网膜上(内丛状层)。健康对照组无沉积。(3)免疫组化显示实验组p38MAPK,JNK1/2在神经纤维层和神经节细胞层有表达,ERK1/2在内界膜上有表达,HO-1在神经节细胞以及视锥视杆细胞层有表达。P38MAPK,JNK1/2,ERK1/2,HO-1在阳性对照组和健康对照组视网膜几乎无表达。(4)分析三组实验兔在4周SDS-PAGE电泳条带灰度值,实验组与阳性对照组,对照组相比,JNK1/2,HO-1,p38MAPK的蛋白质表达水平增高,P<0.05,差异有统计学意义。ERK1/2蛋白质实验组与阳性对照组表达水平相近但仍然增高,P<0.05,差异有统计学意义。钝挫伤所致的玻璃体积血玻璃体腔中存在长时间的铁离子过载现象,尤其是游离铁水平持续维持在高水平状态,导致长时间铁离子介导的氧化损伤,出现持久性视网膜神经上皮层,尤其是光感受器细胞层的损伤。玻血后的铁离子过载与HO-1表达水平上调显著相关,表明HO-1的升高可以通过显著降低活性氧的产生来保护视网膜细胞。且出血后存在显著p38MAPK,JNK1/2,ERK1/2激活现象表明MAPKs信号通路在钝挫伤所致玻血视网膜神经节细胞和Muller胶质细胞损伤以及保护机制中发挥着重要的作用;阳性对照组即非外伤玻血组也会显著激活兔视网膜中的p38MAPK,JNK1/2表达,但却不能上调视网膜中ERK1/2的表达。JNK1/2和p38MAPK信号可能与玻血后视网膜视网膜神经节细胞损害和保护机制有关,而ERK1/2信号通路则可能是介导了玻血后的Muller胶质细胞的保护和修复作用。有关MAPKs信号通路在铁离子过载中的机制尚有待进一步研究。[结论]铁离子过载可能通过激活MAPK信号通路损伤视网膜神经上皮层。因此该实验证实外伤玻血所致铁离子过载对视网膜的毒性作用,提示条件允许时,应尽快玻璃体切除术,清理多余的玻璃体积血,减少铁离子对视网膜的损害。为闭合性眼外伤玻血患者的治疗时机提供理论基础。