[目的]本研究旨在探讨Shh信号通路关键组分在慢性粒细胞白血病患者和健康对照的骨髓单个核细胞的表达差异,以明确Shh信号通路在慢性粒细胞白白血病的活化状态。在此基础上,进一步分析Shh信号通路在慢性粒细胞白血病慢性期、加速期、急变期活化状态的差异,以明确Shh信号通路与慢性粒细胞白血病疾病进展的相关性。[方法]收集我院初诊的慢性期、加速期、急变期的慢性粒细胞白血病患者及健康对照的骨髓标本,分离骨髓单个核细胞。用普通PCR方法(RT-PCR)检测Shh信号通路的关键组分SHH、SMO、PTCH1、GLI1基因在慢性粒细胞白血病患者及健康对照的骨髓单个核细胞的表达差异,并采用更为敏感的Real time PCR (RQ-PCR)技术进一步检测慢性粒细胞白血病各期标本之间及与健康对照之间的SHH、SMO、PTCH1、GLI1基因的表达差异。[结果]Shh信号通路的每一个组分在同一期慢性粒细胞白血病患者不同个体之间存在着差异表达,以慢性期最为显著。大约50%的慢性期标本,70%的加速期标本和80%的急变期标本骨髓单个核细胞Shh信号通路的正向调控组分SHH、SMO、GLI1基因的表达较正常健康对照升高2倍以上,表明慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞存在着Shh信号通路的活化。与慢性期相比,加速期和急变期的患者出现Shh信号通路活化的比例和程度明显增高,表明Shh信号通路与慢性粒细胞白血病的疾病进展正相关。[结论]慢性粒细胞白血.病骨髓单个核细胞存在着Shh信号通路的活化,Shh信号通路与慢性粒细胞白血病的疾病进展相关。[目的]本研究旨在探讨Shh信号通路的关键组分在慢性粒细胞白血病干/祖细胞的表达,以明确Shh信号通路在慢性粒细胞白血病干/祖细胞的活化状态。[方法]收集我院初诊的慢性期、加速期、急变期的慢性粒细胞白血病骨髓标本,流式细胞术检测各期CD34的阳性率。免疫荧光法检测CD34/C-kit与Shh蛋白在加速期和急变期骨髓涂片的共表达。阳性免疫磁珠分选法分离骨髓CD34+细胞。流式细胞术检测磁珠分选的效率。用实时定量PCR方法检测Shh信号通路的关键组分SHH、SMO、PTCH1、GLIl在CD34+细胞与CD34-细胞的表达。用免疫荧光法检测Shh蛋白在CD34+细胞与CD34-细胞的表达。分离骨髓基质细胞,免疫荧光法检测Shh蛋白在骨髓基质细胞的表达。用普通PCR的方法检测Shh信号通路的关键组分SHH、SMO、PTCH1、GLI1在慢性粒细胞白血病细胞系K562的表达,免疫荧光法检测Shh蛋白在K562细胞的表达。[结果]CML-CP、CML-AP、CML-BP标本的CD34+细胞分别在0.2%～2.0%、4.0%～10.0%、12.5%～97.5%范围内。CD34和Shh蛋白以及c-kit和Shh蛋白在加速期和急变期的骨髓涂片中呈现一致性表达,即高表达CD34或c-kit的细胞同时高表达Shh蛋白,而低表达CD34或c-kit的细胞同时低表达Shh蛋白。磁珠分选的CD34+细胞的在95%以上。纯化的CD34+细胞与CD34-细胞相比,高表达Shh信号通路的正向调控组分SHH、SMO、GLI1,而低表达Shh信号通路的负向调控组分PTCH1。CD34+和CD34"细胞内也可见CD34与Shh蛋白的一致性表达。慢性粒细胞白血病骨髓基质细胞低表达Shh蛋白。K562细胞表达Shh信号通路的关键组分,Shh蛋白在K562细胞内呈现差异表达：部分细胞高表达Shh蛋白,其余细胞低表达Shh蛋白。[结论]慢性粒细胞白血病干/祖细胞内存在着Shh信号通路的活化,自我分泌的Shh蛋白介导了慢性粒细胞白血病干/祖细胞内Shh信号通路的自我激活。[目的]本研究旨在探讨Shh信号通路对慢性粒细胞自血病干/祖细胞生存和增殖的影响。[方法]磁珠分选性慢粒细胞白血病加速期、急变期的骨髓CD34+和CD34-的细胞,纯化的CD34+和CD34-的细胞于10ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6、50ng/ml SCF培养条件下培养。CD34+和CD34-的细胞均分别用外源性Shh肽和Shh通路的抑制剂cyclopamine作用72h,MTT法检测细胞增殖。K562细胞进行以下分组(1)对照组(2)Shh组(500ng/ml)(3) cyclopamine组(4)Shh(500ng/ml)+cyclopamine(10μM)组,24、48h后收获细胞,MTT法检测细胞增殖。Shh信号通路的抑制剂5E1单克隆抗体(4、6、8、10、20、30μg/ml)和cyclopamine(10、20、40μM)分别作用于K562细胞,24h后采用普通光学显微镜观察细胞数目的变化,Annexin V/PI法检测细胞的凋亡率,PI法检测细胞周期。体外化学合成针对GLI1的小干扰RNA (siRNA),通过脂质体(Lipofectamine2000)介导将其导入K562细胞,并以非特异性的siRNA转染的细胞作为对照。设置siRNA浓度梯度(40、60、80、100、200pmol),检测转染效率,探索最佳转染浓度。实时定量PCR和western blot法检测siRNA的沉默效应。MTT法检测转染后24、48h细胞的增殖能力。[结果]纯化的CD34-细胞在外源性Shh肽的作用下,经过72h细胞扩增了1.18±0.04倍,纯化的CD34+细胞扩增了1.64±0.11倍,CD34+细胞的扩增幅度明显高于CD34-细胞(P<0.01)。纯化的CD34-细胞在外源性cyclopamine作用下,经过72h,细胞数目为最初的0.75±0.03倍,而CD34+细胞为最初的0.88±0.04倍,CD34+细胞的凋亡幅度明显低于CD34-细胞(P<0.01)。经过24h,对照组的K562细胞数目是最初的1.57±0.09倍,Shh组是最初的1.63±0.10倍(与对照相比,P=0.13),cyclopamine组是最初的1.05±0.08倍(P<0.01),Shh+cyclopamine组是最初的1.17±0.09倍(P<0.01),经过48h,对照组的K562细胞数目是最初的1.32±0.08倍,Shh组是最初的1.78±0.07倍(与对照组相比,P<0.01),cyclopamine组是最初的0.64±0.07倍(P<0.01),Shh+cyclopamine组是最初的0.72±0.10倍(P<0.01)。表明外源性Shh肽促进了K562细胞的增殖,而cyclopamine诱导了K562细胞凋亡,并呈现时间依赖性。5E1单克隆抗体和cyclopameine以剂量依赖的方式诱导了K562细胞的凋亡,并诱导了K562细胞G2/M期阻滞。转染后24h,实验组GLI1mRNA表达水平为对照组的(52.60±3.57)%(P<0.01),48h为对照组的(88.83±5.21)%(P=0.01),72h为对照组的1.36±0.11倍(P<0.01)。转染后24h实验组Glil的蛋白表达水平为对照组的(88.60±6.13)%(P=0.02),48h为对照组的(79.31±5.58)%(P<0.01)。转染后24h实验组细胞数目为对照组的(94.41±3.58)%(P=0.05),48h为对照组(90.22±3.34)%(P<0.01),表明GLI1 siRNA抑制了GLI1的表达,并诱导了细胞凋亡。[结论]自我激活的Shh信号通路维持了慢性粒细胞白血病干/祖细胞的生存,并促进了其增殖,靶向抑制Shh信号通路可以导致慢性粒细胞白血病干/祖细胞的凋亡和细胞周期阻滞。[目的]本研究旨在通过研究慢性粒细胞白血病干/祖细胞内Shh信号通路与Wnt信号通路的关系及相互作用以明确Shh信号通路调控CML干/祖细胞的机制。[方法]磁珠分选慢性粒细胞白血病加速期、急变期的骨髓标本的CD34+和CD34-的细胞。免疫荧光法检测Shh蛋白和P-catenin蛋白在CD34+和CD34-的细胞表达。分离骨髓基质细胞,免疫荧光法检测Shh蛋白和P-catenin蛋白在骨髓基质细胞的表达。RT-PCR检测Shh信号通路的关键组分和Wnt信号通路的关键组分在K562细胞的表达,免疫荧光法检测Shh蛋白和β-catenin蛋白的表达。将K562细胞进行如下分组(1)对照组(2)Shh抗体组(10μg/ml) (3) Shh抗体(10μg/ml)+Wnt3a (500ng/ml)组(4) Wnt3a抗体(10μg/ml) (5) Wnt3a抗体(10μg/ml)+Shh-N (500ng/ml)组,Annexin V/PI检测各组的凋亡率。RT-PCR检测K562细胞在10μg/ml Shh抗体作用24h后GLI1、β-CATENIN、C-MYC的表达变化。Real time PCR检测K562细胞分别在10μg/ml Shh抗体作用24h后GLI1、β-CATENIN、C-MYC、、P21 BCL-2的表达变化。[结果]CD34+及CD34-的细胞、骨髓基质细胞、K562细胞内均呈现Shh蛋白和β-catenin蛋白的共表达。K562细胞表达Shh信号通路和Wnt信号通路关键组分。K562细胞对照组24h后的凋亡率是4.15±1.02%,Shh抗体组(10μg/ml)的凋亡率是15.88±2.87%,Shh抗体(10μg/ml)+Wnt3a (500ng/ml)组的凋亡率是8.41±1.38%(与Shh抗体组相比P＜0.01), Wnt3a抗体(10μg/ml)的凋亡率是17.34±3.15%, Wnt3a抗体(10μg/ml)+Shh-N (500ng/ml)组凋亡率是14.89±2.79%(与Wnt3a抗体组相比,P=0.60)。即Wnt3a能部分逆转Shh抗体诱导的细胞凋亡,而Shh-N不能逆转Wnt3a抗体诱导的细胞凋亡,表明Wnt信号通路位于Shh信号通路的下游。K562细胞在10μg/ml Shh抗体作用24 h后GLI1的表达下降了7.92±0.89倍,β-CATENIN的表达下降了0.21±0.14倍,C-MYC的表达下降了4.95±0.57倍,P21的表达上调了11.57±1.23倍,BCL-2的表达下调了2.55±0.21倍。GLI1、C-MYC、BCL-2的表达下降,而P21的表达升高,β-CATENIN的表达无明显变化。[结论]Wnt信号通路位于Shh信号通路的下游,Shh信号通路通过作用于Wntt信号通路的靶基因维持了慢性粒细胞白血病干/祖细胞的生存和增殖。