【摘 要】
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目的目前中药市场中,资源匮乏的贵细药材造假频出,本课题分别选取了其中基原复杂、传统性状及理化鉴别难以判断其真实性的植物性药材川贝母和和动物性药材鹿角做为研究对象,研究基于PCR原理的分子鉴定方法,对这两种药材进行真伪判定及掺假测定方法研究。方法1.川贝母收集《中国药典》2015年版一部中收载的6种基原的川贝母药材及市场上常见的贝母品种,采用试剂盒提取样品中的总DNA,通过对目标基因ITS1的序列分
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目的目前中药市场中,资源匮乏的贵细药材造假频出,本课题分别选取了其中基原复杂、传统性状及理化鉴别难以判断其真实性的植物性药材川贝母和和动物性药材鹿角做为研究对象,研究基于PCR原理的分子鉴定方法,对这两种药材进行真伪判定及掺假测定方法研究。方法1.川贝母收集《中国药典》2015年版一部中收载的6种基原的川贝母药材及市场上常见的贝母品种,采用试剂盒提取样品中的总DNA,通过对目标基因ITS1的序列分析比对,找出其中的差异位点,并根据差异位点设计双杂交探针,测定双杂交探针的高分辨率熔解曲线,计算其Tm值,通过Tm值进行真实性判定。并将市场上最为普遍的川贝母基原之一的太白贝母与最常见冒充品种伊贝母进行不同比例混合作为掺伪模型,采用本论文中建立的方法测定掺伪模型高分辨率熔解曲线,对掺伪测定进行研究。2.鹿角选取《中国药典》2015年版一部中收载的2种基原鹿角药材与鹿科动物中其他18个种属及市场中可能的造假来源猪、牛、羊骨作为区分目标,通过生物信息学方法,以线粒体DNA作为目标基因对以上23个种属进行序列分析,并根据序列分析结果设计特异性引物探针组合及通用性引物探针组合,根据是否产生扩增曲线判断样品的真伪。将鹿角基原之一的马鹿角粉与市场中最为常见的伪品驯鹿角粉进行不同比例混合作为掺伪模型,采用本论文中建立的方法,分别绘制通用性引物探针及特异性引物探针Ct值与DNA模板浓度对数的标准曲线,通过标准曲线分别计算样本的初始DNA模板浓度,以特异性引物探针与通用性引物探针计算的初始DNA模板浓度比值计算真品样本的比例。结果（1）通过双杂交探针的高分辨率熔解曲线计算的Tm值,6种基原的川贝母熔解曲线的Tm值均在72℃左右,伊贝母、浙贝母及湖北贝母Tm值在64℃左右,平贝母的Tm值在62℃左右,皖贝母的熔解曲线不显示Tm值,可明显快速将其区分;并且通过对掺伪模型的测定发现,可根据高分辨率熔解曲线的峰型对30%以上掺伪比例进行识别。（2）根据鹿角真伪品在线粒体DNA序列中的差异位点成功设计特异性引物探针组合,在实际样品的验证中,正品马鹿与梅花鹿鹿角可显示特异性引物探针的扩增曲线,其他驯鹿、麋鹿及猪、牛、羊均不显示;所有样品均显示通用性引物探针组合的扩增曲线。通过对掺伪模型的测定显示,该方法可对掺伪比例在50%以上的样本进行掺伪定量。结论本课题基于实时荧光定量PCR技术建立了川贝母及鹿角的真伪鉴别方法,可以准确进行真实性鉴别,可对较大比例的掺伪进行识别;具有鉴别准确、判定明确、方便快捷、污染少的优点,可作为药典方法的补充,弥补了现有方法的不足,并可进一步转化为标准,对川贝母及鹿角市场具有一定的规范化作用,具有一定的实际应用价值。
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